超声波辅助提取常熟黑米类黄酮及其抗氧化活性分析

杨志刚，张燕萍，杨海定

(常熟理工学院生物与食品工程系，江苏 常熟 215500)

超声波辅助提取常熟黑米类黄酮及其抗氧化活性分析

杨志刚，张燕萍，杨海定

(常熟理工学院生物与食品工程系，江苏 常熟 215500)

以常熟黑米类黄酮的提取率为指标，采用单因素试验和正交试验对超声波辅助提取工艺条件进行优选，并通过测定常熟黑米类黄酮对DPPH自由基、羟自由基(•OH)、超氧阴离子自由基(O-2•)的清除作用，研究其抗氧化活性。结果表明：常熟黑米类黄酮最佳提取工艺条件为料液比1:60(g/mL)、乙醇体积分数60%、超声功率288W、浸提温度50℃、浸提时间40min，在此条件下提取率为1.415%。常熟黑米类黄酮表现出较好的抗氧化活性，且与质量浓度呈正相关，但抗氧化能力小于VC，是一种很好的天然抗氧化剂。

常熟黑米；类黄酮；超声波辅助提取；抗氧化

常熟黑米又名“血糯83-1”，是我国稀特稻米品种鸭血糯改良种，富含蛋白质、维生素、天然色素及人体必需的多种微量元素，同时还含有水溶性类黄酮以及生物碱、植物甾醇等药用成分，具有较高的营养、药用和经济价值，是一种上乘的滋补美食佳品，亦为食品加工、酿造业及提取天然色素的珍贵稻米。类黄酮是植物重要的次生代谢产物，存在于水果、蔬菜、谷物、豆类和茶叶等许多食源性植物中，具有高抗氧化和抗自由基作用，能够维持血管的正常渗透压，减低血管的脆性，防止血管破裂，止血消炎，抗过敏、抗病毒，同时还有抗衰老、抗突变等保健功能[1-6]。

传统的类黄酮提取方法为煎煮法、回流提取法、索氏提取法、浸渍法、渗透法、水蒸汽蒸馏法等[7-12]。超声技术的高频振动及空化效应，可以破坏细胞组织从而强化浸提效果，具有提取时间短、效率高等优点，近年来已广泛应用于天然活性物质的提取[13-16]。本实验以常熟黑米为原料，探讨超声波辅助提取总黄酮的最佳工艺，并研究提取物在体外的抗氧化能力，希望为进一步有效利用常熟黑米这一宝贵植物资源提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

常熟黑米，2012年11月采收于江苏省常熟市农业科学研究所大义种植基地。

芦丁标准品 上海亿欣生物科技有限公司；亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、乙醇、VC、BHT均为国产分析纯。

BELMark分析天平 深圳市华恒仪器有限公司；六一牌WD9419型电动粉碎机 沃德生物医学仪器公司；Lambda25紫外-可见分光光度计 美国Perkin Elmer公司；FQ-ⅡD超声波细胞粉碎机 南京先欧仪器制造有限公司；LNG-788台式快速离心浓缩干燥器 太仓市华美生化仪器厂；HH-S4数显恒温水浴锅 金坛市医疗仪器厂。

1.2 方法

1.2.1 常熟黑米类黄酮的制备

常熟黑米去颖壳后50℃条件下干燥至恒质量，粉碎，过60目筛。取10g过60目筛的常熟黑米粉，加60%乙醇溶液600mL，料液比1:60(g/mL)、超声功率288W、浸提温度50℃、提取时间40min，抽滤，以100mL提取溶剂洗涤滤渣，合并2次滤液，浓缩至黏稠状，于真空干燥箱(60℃、90MPa)中干燥得粉末2.34g，类黄酮含量为6.02%，避光保存[18]。

1.2.2 类黄酮含量测定

精确称取芦丁对照品25.00mg，置于100mL容量瓶中，加入60%乙醇溶液，稀释至刻度，摇匀，定容。即芦丁标准样品质量浓度为0.25mg/mL。精密量取标准溶液0、1、2、3、4、5、6、7、8mL于25mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.5mL，摇匀静置5min；再加入10%硝酸铝溶液0.5mL，摇匀静置6min，再加入4g/100mL氢氧化钠溶液5mL，摇匀静置5min，最后用60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀静置10min。以第一瓶为空白对照液，用Lambda25紫外-可见分光光度计在510nm波长处测定吸光度。以吸光度A对质量浓度(ρ)进行回归，得回归方程[17]。

分别加入一定量的常熟黑米类黄酮提取液，经离心过滤后，定容至100mL；精确吸取10mL于50mL容量瓶中，加入5%亚硝酸钠溶液0.5mL，摇匀静置5min，再加入10%硝酸铝溶液0.5mL，摇匀静置6min，再加入4g/100mL氢氧化钠溶液5mL，摇匀静置5min，最后用60%乙醇溶液定容至刻度，摇匀静置10min，于510nm波长处测其吸光度[17]。

式中：ρ为稀释后样品检测溶液中类黄酮质量浓度；n为稀释倍数；V为样品提取液第1次定容的体积；m为常熟黑米粉末质量。

1.2.3 单因素试验

分别考察乙醇体积分数(50%、60%、70%、80%、90%)、浸提温度(30、40、50、60、70℃)、料液比(l:20、1:30、l:40、1:50、1:60、1:70)、超声功率(192、240、288、336、384W)、超声波浸提时间(10、20、30、40、50min)对黄酮提取率的影响。

1.2.4 正交试验

根据单因素的试验结果，设计正交试验的因素水平，见表1，优化超声波辅助提取常熟黑米类黄酮的工艺条件。

表1 正交试验因素与水平Table1 Factors and levels used in orthogonal array design

1.2.5 抗氧化活性的测定

1.2.5.1 对DPPH自由基清除能力的测定[19]

精确吸取2mL不同质量浓度(2、4、6、8、10mg/L)干燥样品于试管中，分别加入2mL 0.2mol/L DPPH乙醇溶液，摇匀后置于25℃条件下恒温水浴锅中加热30min，在517nm波长处测定吸光度Aa。同时测定2mL不同质量浓度样品提取液与2mL无水乙醇混匀后的吸光度Ab和2mL DPPH溶液与2mL无水乙醇混匀后的吸光度A0。用等质量浓度的VC、BHT代替样品做对照，按式(2)计算清除率：

1.2.5.2 对•OH清除能力的测定[20]

精确吸取3mL不同质量浓度(2、4、6、8、10mg/L)样品醇溶物于试管中，依次向试管中加入2mL 0.1moL/L FeSO4、2mL 0.1mol/L水杨酸、2mL 0.1mol/L H2O2，用蒸馏水定容至10mL并摇匀，在37℃条件下恒温加热30min后在510nm波长处测定其吸光度Aa；将体系中样品用3mL无水乙醇代替，在相同条件下测定其吸光度A0；将体系中H2O2用蒸馏水代替在相同条件下测定其吸光度Ab。用等质量浓度的VC、BHT代替样品做对照，按式(3)计算清除率：

向各容量瓶中加入3mmoL/L邻苯三酚溶液0.3mL，再分别加2mL不同质量浓度的样品醇溶物，用pH8.3的Tris-HCl缓冲溶液定容至9mL，迅速混匀并以蒸馏水作参比，在325nm波长处每隔30s测吸光度，直到反应启动后的第6分钟结束测定，把所得的数据以时间为横坐标，吸光度为纵坐标进行线性回归曲线，得到的直线斜率为反应速率ΔA、ΔA0，用等质量浓度的VC、BHT代替样品做对照。清除率按式(4)计算：

式中：ΔA0为邻苯三酚的自氧化法速率；ΔA为加入样液后邻苯三酚自氧化法速率(单位均为吸光度每分钟的增值)。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 浸提温度对常熟黑米类黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%、超声功率240W、超声提取时间30min、料液比1:50(g/mL)，提取温度分别为30、40、50、60、70℃时，测定波长510nm处的吸光度，计算类黄酮提取率。

图1 浸提温度对提取效果的影响Fig.1 Effect of temperature on the extraction of flavonoids

由图1可知，随着浸提温度的升高，类黄酮提取率逐渐升高，而后呈现下降的趋势。浸提温度为60℃时，类黄酮溶出较多。浸提温度在70℃的条件下类黄酮提取率反而比在60℃低，这是由于当温度过高时，乙醇气化，不利于活性成分的析出，而且温度过高，杂质溶出量也相应增大，活性成分易分解破坏。因此，浸提温度选择60℃较为适宜。

2.1.2 料液比对常熟黑米类黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%、浸提温度60℃、超声功率240W、超声提取时间30min，料液比分别为1:20、1:30、1:40、1:50、1:60、1:70(g/mL)时，测定波长510nm处吸光度，计算类黄酮提取率。

图2 料液比对提取效果的影响Fig.2 Effect of solid-to-solvent ratio on the extraction of flavonoids

从图2可以看出，随着提取液用量的增加，类黄酮提取率也随之增大，当提取液用量增大到一定值后，类黄酮提取率的增加趋于平缓。考虑到提取液用量的提高也会增加生产成本及后续工艺的难度，所以料液比选择1:60(g/mL)较适宜。

2.1.3 超声功率对常熟黑米类黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%、浸提温度60℃、料液比1:60(g/mL)、超声提取时间30min、超声功率分别为192、240、288、336、384W，测定波长510nm处吸光度，计算类黄酮提取率。

图3 超声功率对提取效果的影响Fig.3 Effect of ultrasonic power on the extraction of flavonoids

由图3可见，随着超声功率增加，类黄酮提取率逐渐升高，而后呈现略有下降的趋势。超声功率小时，不能使物料充分受到超声的作用，类黄酮提取不完全，在超声功率达到288W时提取率达到最大，之后，类黄酮提取率有所下降，这可能是因为超声功率太大造成类黄酮降解，因此，选择超声功率为288W较为宜。

2.1.4 提取时间对常熟黑米类黄酮提取率的影响

在乙醇体积分数70%、浸提温度60℃、料液比1:60(g/mL)、超声功率288W，提取时间分别为10、20、30、40、50min时，测定波长510nm处吸光度，计算类黄酮提取率。

图4 浸提时间对提取效果的影响Fig.4 Effect of time on the extraction of flavonoids

从图4可知，在浸提过程中，细胞内外活性成分含量未达到平衡时，提取率随浸提时间的延长而增加，当细胞内外浓度达到平衡，活性成分不再溶出，提取率趋于稳定。浸提时间在30min后，类黄酮得率提高不显著，因此选择浸提时间30min为宜。

2.1.5 乙醇体积分数对常熟黑米类黄酮提取率的影响

在浸提温度60℃、料液比1:60(g/mL)、超声功率288W、超声提取时间30min、乙醇体积分数分别为50%、60%、70%、80%、90%时，测定波长510nm处吸光度，计算类黄酮提取率。

图5 乙醇体积分数对提取效果的影响Fig.5 Effect of ethanol concentration on the extraction of flavonoids

由图5可见，乙醇体积分数对提取效果影响较大，当体积分数达到70%时提取效果最佳，乙醇体积分数较高和较低提取效果均不佳。这可能是不同体积分数的乙醇极性不同，导致对类黄酮物质的溶解能力不同。

2.2 正交试验

为了确定在多因素条件下超声辅助提取常熟黑米类黄酮的最佳工艺，在单因素试验的基础上，选择合适的参数范围，对浸提温度(A)、料液比(B)、超声功率(C)、浸提时间(D)、乙醇体积分数(E)，采用L16(45)进行正交试验，优化最佳提取工艺见表2。

表2 L 2 L1616(4(45)正交试验设计及结果Table2 Orthogonal array design and results

表3 L 3 L1616(4(45)正交试验优化工艺方差分析Table3 Analysis of variance for the experimental results array design

由表2、3可知，试验中各因素对常熟黑米类黄酮提取率的影响程度依次为B＞E＞C＞A＞D，即料液比＞乙醇体积分数＞超声功率＞浸提温度＞浸提时间。常熟黑米类黄酮提取最佳工艺参数是A2B4C3D3E1，即料液比1:60(g/mL)、乙醇体积分数60%、超声功率288W、浸提温度50℃、提取时间40min。在最优条件下，重复3次测常熟黑米类黄酮得率平均值为1.415%，与正交试验基本符合。

2.3 常熟黑米类黄酮的抗氧化活性

2.3.1 对DPPH自由基的清除能力

在相同条件下，不同质量浓度VC、常熟黑米类黄酮、BHT对DPPH自由基的清除能力如图6所示，VC、常熟黑米类黄酮、BHT对DPPH自由基均有较好的清除效果，且在实验质量浓度范围内随质量浓度的增加而增强。结果表明，在所选质量浓度范围内，DPPH自由基清除能力的大小顺序为VC＞BHT＞常熟黑米类黄酮。4mg/L常熟黑米类黄酮的清除率与BHT的清除率最接近，分别为26.7%和29.2%。

图6 常熟黑米类黄酮对DPPH自由基的清除能力Fig.6 DPPH radical scavenging activity of flavonoids from Changshu black rice

2.3.2 对•OH的清除能力

图7 常熟黑米类黄酮对•OH的清除能力Fig.7 Hydroxyl radical scavenging activity of flavonoids from Changshu black rice

由图7可知，在所选质量浓度范围内，VC、常熟黑米类黄酮、BHT清除•OH的能力均与质量浓度呈正相关。在2～10mg/L质量浓度范围，常熟黑米类黄酮清除能力增幅较大，在质量浓度10mg/L时，达到53.01%。在整个测定的质量浓度范围内，常熟黑米类黄酮对•OH的清除率为27.45%～53.01%，小于VC对•OH的清除率(30.45%～56.63%)，大于BHT对•OH的清除率(24.24%～44.35%)。

2.3.3 对O-2・的清除能力

图8 常熟黑米类黄酮对O－2•的清除能力Fig.8 Superoxide anion radical scavenging activity of flavonoids from Changshu black rice

由图8可知，在所选质量浓度范围内，体系中加入不同质量浓度的VC、常熟黑米类黄酮、BHT后，清除率均呈现上升趋势，说明VC、常熟黑米类黄酮、BHT对均有抑制作用，抑制率与质量浓度有关，加入样品的质量浓度越大，其对的抑制作用越强。实验结果表明，在所选质量浓度范围内，清除能力的大小顺序为VC＞常熟黑米类黄酮＞BHT。

3 结 论

相比于传统索氏提取法提取总黄酮，超声波辅助提取法不仅可降低成本，还大大提高了黄酮的提取效率。超声波提取可大大节省提取时间，同时超声波有促使植物细胞破壁能力，提高功能成分的提取率。通过单因素试验和正交试验，以乙醇为提取溶剂，超声辅助提取常熟黑米类黄酮，在实验范围内，对实验指标影响的因素从主到次顺序是料液比影响最大，其次为乙醇体积分数、超声功率和浸提温度，而超声提取时间影响最小；优化的最佳工艺条件为：料液比1:60(g/mL)、乙醇体积分数60%、超声功率288W、浸提温度50℃、提取时间40min，在此条件下常熟黑米类黄酮提取率为1.415%。

常熟黑米提取得到的类黄酮属于天然植物次生代谢产物。通过对DPPH自由基、•OH、O-2•清除能力的大小研究常熟黑米类黄酮的抗氧化性能，并以VC、BHT作参比对照，得到如下结论，清除DPPH自由基能力的大小为VC＞BHT＞常熟黑米类黄酮；清除•OH、O-2•能力的大小均为VC＞常熟黑米类黄酮＞BHT。常熟黑米类黄酮具有一定的抗氧化性能，因此在天然抗氧化剂和功能食品的开发方面均显示出良好的前景。

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Ultrasonic-Assisted Extraction and Antioxidant Activities of Flavonids from Changshu Grown Black Rice

YANG Zhi-gang，ZHANG Yan-ping，YANG Hai-ding
(Department of Biology and Food Engineering, Changshu Institute of Technology, Changshu 215500, China)

The ultrasonic-assisted extraction of flavonoids from Changeshu grown black (duck blood) rice was optimized by single-factor experiments and orthogonal experiment design to obtain maximum flavonoid yield. The extracted flavnoids were investigated for their antioxidant activities by DPPH radical scavenging, hydroxyl radical scavenging and superoxide anion radical scavenging assays. The results showed that the optimum extraction conditions for solid-to-solvent ratio, ethanol concentration, ultrasonic power, temperature and time were 1:60 (g/mL), 60%, 288 W, 50 ℃ and 40 min, respectively. The maximum yield of flavonoids under these conditions was 1.415%. The flavonoids obtained exhibited powerful antioxidant activity in a concentrationdependent manner, which, however, was inferior to that of VC. Therefore, this study concludes that Changshu black rice is a good source of natural antioxidants.

Changshu black rice；flavonoids；ultrasonic-assisted extraction；antioxidant

TS201.1；TS218

A

1002-6630(2013)18-0118-05

10.7506/spkx1002-6630-201318024

2013-03-25

杨志刚(1977—)，男，讲师，硕士，主要从事天然活性产物综合利用研究。E-mail：zgy@cslg.edu.cn