用于腺苷检测的基于级联扩增核酸适体电化学传感界面的构建研究

王君霞，何婧琳，曾利红，伍 娉，朱爽丽，曹 忠

(长沙理工大学化学与生物工程学院，电力与交通材料保护湖南省重点实验室，湖南长沙410004)

用于腺苷检测的基于级联扩增核酸适体电化学传感界面的构建研究

王君霞，何婧琳*，曾利红，伍 娉，朱爽丽，曹 忠*

(长沙理工大学化学与生物工程学院，电力与交通材料保护湖南省重点实验室，湖南长沙410004)

该文报道了一种基于酶级联扩增的电化学核酸适体检测腺苷的新方法。当腺苷存在时，滚环扩增的引物通过E.coli DNA连接酶的作用与通过巯基组装在金电极上的固定探针连接。在pHi29 DNA聚合酶的作用下，滚环扩增反应进行并产生一条与环形探针完全互补的长的单链，然后将大量金纳米粒子标记的核酸探针与滚环扩增的产物杂交。该传感界面电化学行为的结果表明，通过酶级联扩增的方法提高了检测腺苷的阻抗响应灵敏度，且选择性和重现性良好。用于腺苷的检测时，其线性范围为2.0 μmol/L~100 μmol/L，最低检测浓度为2.0 μmol/L，表明该传感界面的设计可作为一种通用方法而有望用于其它目标物的检测。

传感界面设计；核酸适体；工具酶级联扩增；电化学阻抗；腺苷

0 引言

核酸适体（Aptamer，源于拉丁语）指的是经体外筛选技术SELEX(指数富集配体系统进化)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。近年来，基于核酸适体己发展了腺苷[1]、可卡因[2]等小分子和凝血酶[3]、溶菌酶[4]等蛋白质分子的生物传感器，在临床应用和基础研究中发挥着越来越重要的作用[5]，特别是DNA连接酶反应[6~7]和滚环扩增(rolling circleamplification，RCA)技术[8~9]以其高特异性和强大的扩增能力受到广泛关注。首先，连接酶只能在连接位点催化两个并列的并且和目标序列匹配的DNA链，如果在这两条DNA链和目标DNA链中的连接位点碱基不匹配，那么连接反应就不能进行[10]，因此，DNA连接酶能很好的提高检测的特异性。如Wu等[11]结合连接酶与反向分子信标联用，利用二茂铁靠近电极表面来实现对目标的检测。其次，滚环放大体系的核心是噬菌体pHi29 DNA聚合酶，具有持续合成效率高、性能稳定的优点，将聚合酶对DNA的特定作用应用于核酸探针分析中，极大地提高了检测灵敏度。如Ellington等将滚环扩增技术与核酸适体相结合，利用核酸适体探针与目标物相结合导致核酸适体探针的构象发生变化，从而引发线型挂锁探针连接成环后进行滚环扩增，分别实现了对表皮生长因子PDGF[8]和三磷酸腺苷ATP[9]的放大检测。

在电化学传感器的设计中，用于提高检测灵敏度的信号放大方法有滚环放大[12~13]、酶标放大[14]、基于纳米材料的信号放大[15~16]、链置换信号放大[17~18]及场效应晶体管信号放大技术等[19]，其中采用纳米材料放大信号的方法近年来发展较快，它不需要特别复杂的分子生物学操作，且对目标物检测具有高灵敏度、高特异性的特点[20]。

该文设计了一种基于工具酶级联扩增核酸（Guanine）、胞嘧啶（Cytosine）和尿嘧啶（Uridine）购自捷瑞生物工程有限公司 （上海）；E.coli DNA连接酶和dNTP购自大连宝生物工程公司；pHi29 DNA聚合酶购自New England Biolabs有限公司；Triton X-100购自生工生物工程 （上海）有限公司；氯金酸购自于国药集团化学试剂有限公司；其它试剂均为国产分析纯，实验用水为经适体电化学传感界面用于腺苷的检测。该方法联用连接酶和滚环扩增酶，使腺苷存在下固定于电极上的引物循环生长，继而大量自组装金纳米粒子，导致电信号极大增强。该方法利用工具酶的高效性和高保真性，有效地提高了小分子传感识别的灵敏度、特异性，在分子识别传感界面构建方面具有重要意义。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

CHI-660B电化学工作站 （上海辰华仪器公司），Microfuge 22R型台式微量冷冻离心机（贝克曼库尔特有限公司，美国），KQ3200B超声波清洗器 （昆山市超声仪器公司），CS501-3C型超级数显恒温器（重庆四达实验仪器有限公司）。采用三电极体系，工作电极为金电极，参比电极为Ag/AgCl（饱和KCl），对电极为铂丝电极。

实验所用核酸适体序列均购自于生工生物工程（上海）有限公司，粗斜体部分表示腺苷核酸适体序列（见表1）。杂交探针、启动探针、环形探针和检测探针均用25 mmol/L Tris-HCl缓冲液（含有 140 mmol/L NaCl和 2 mmol/L MgCl2，pH7.4）溶解和稀释。将固定探针溶于含有300 mmol/L NaCl和 2 mmol/L MgCl2的 25 mmol/L Tris-HCl溶液（pH7.5）得到浓度为2 μmol/L的固定探针溶液。 腺苷 （Adenosine）、鸟嘌呤过重蒸馏的高纯去离子水，配制生物试剂所用水和缓冲溶液均经高温高压灭菌。

表1 核酸适体探针序列Tab.1 The sequence of aptamer probes

1.2 金纳米粒子（AuNPs）的制备与标记

AuNPs采用柠檬酸钠还原法制备[21]：所用玻璃器皿置于新鲜配置的王水(V(浓盐酸)∶V(浓硝酸)=l∶3)中浸泡，超纯水充分清洗干净。于99 mL超纯水中加入1 mL l%的氯金酸，搅拌加热至沸腾，然后迅速加入3 mL 1%的柠檬酸钠，观察溶液由淡黄色逐渐变为稳定的红色，继续搅拌1 h，然后冷却至室温。将制备好的AuNPs溶液置于棕色玻璃试剂瓶中，4℃下保存备用。

AuNPs标记检测探针具体过程如下[22]：取1 mL AuNPs于3 000 r/min、0℃离心8 min，取上清液加入王水泡过的比色管，分40次向比色管中加入100 μL 20 μmol/L的检测探针。然后缓慢加入50 μL 200 mmol/L的Tris溶液到比色管中，冷藏放置过夜。继续缓慢向比色管中加入50 μL 2 mmol/L的NaCl冷藏放置40 h。最后加入100 μL 5%的Triton X-100，以10 000 r/min、0℃离心10 min，去上清液，下层油状液在1 mL Tris溶液中避光保存。

1.3 金电极预处理与传感器制备

首先将半径为1 mm的金电极依次用0.3 μm、0.05 μm的Al2O3粉抛光10 min，依次用去离子水、无水乙醇、去离子水超生清洗10 min，然后放置在Piranha溶液（H2O2∶H2SO4=3∶7）中浸泡20 min，最后在0.1 mol/L H2SO4溶液中进行循环伏安（CV）扫描，电位范围为-0.3~1.55 V。

在预处理过的金电极上滴加15 μL 2 μmol/L固定探针冷藏孵育12 h，用1 mmol/L巯基乙醇封闭6 min。轻柔冲洗未反应的探针和巯基乙醇后，电极分别在含有2 μmol/L杂交探针、特定浓度的腺苷、10 μmol/L启动探针及1 μL E.coli DNA连接酶混合液中恒温37℃培育80 min。电极表面依次滴加2.5 μmol/L环形探针、2.5 mmol/L dNTP及0.2 μL pHi29 DNA聚合酶，于37℃恒温孵育2 h。最后将15 μL标记好AuNPs的检测探针滴加在电极上于18℃孵育1 h，再进行电化学检测。

2 结果与讨论

2.1 传感探针界面设计与机理探讨

传感探针界面设计如图1所示。固定探针借助Au-S键作用自组装到金电极表面。杂交探针在腺苷的作用下开环与固定探针及腺苷分子形成复合物。启动探针与杂交探针部分杂交，在连接酶的作用下切口抚平，启动探针连接于电极表面。由于启动探针的3’端部分序列与环形探针杂交，加入滚环扩增酶，启动探针以环形探针为模板不断复制延长。然后加入标记AuNPs的核酸短链，该核酸短链能与滚环扩增生长得到的长链杂交，至此，电化学传感界面上由于腺苷分子的存在聚集了大量的金纳米粒子，实现传感器阻抗信号的增大。若传感界面没有腺苷分子出现，杂交探针不会开环，工具酶级联扩增反应和AuNPs的自组装皆不能发生。

图1 用于腺苷检测的工具酶级联扩增核酸适体电化学传感界面设计示意图Fig.1 Schematic diagram for design of an enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensing interface which is used for adenosine detection

传感探针界面上实现腺苷检测的关键之处在于腺苷识别元件的设计，腺苷的结合位点分别在固定探针的3’端和杂交探针的3’端，在没有腺苷存在时，杂交探针的两端互相杂交形成发夹型的二级结构，不能与组装在金电极上的固定探针结合。因此，金电极上始终只组装有固定探针，电化学信号没有明显变化。而当腺苷存在时，杂交探针的发卡型结构打开，并与固定探针的3’端杂交，同时将腺苷包裹其中，于是，杂交探针成功组装到金电极上，为后续组装的信号放大提供了可能。该传感探针界面设计采用了滚环扩增方法（RCA）和向金电极上组装上大量AuNPs来实现对电化学信号的放大。在RCA反应中，短的环型单链DNA作为DNA聚合酶的模板，在dNTP存在下，产生大量的、与环形探针互补的单链DNA长链，在该长链上杂交上修饰有AuNPs的核酸短链，从而将AuNPs组装上金电极表面，AuNPs所具有的表面效应和体积效应使得电极阻抗信号值明显增加。

所设计的传感探针界面的优点在于，目标识别和RCA反应均直接在传感界面上进行，省去了传统操作中先在均相中进行反应，然后将反应混合液滴加到传感界面的复杂步骤，具有重要的基础研究与应用价值。

2.2 传感界面的电化学行为

实验考察了电化学传感界面制作过程中电极逐步修饰的交流阻抗（图2A）和循环伏安（图2B）行为。在图2A中，裸金电极（曲线a）的阻抗值很小，说明预处理过后的金电极传递电子能力很强。修饰了固定探针的电极（曲线b）阻抗值略有增加，达到4 000 Ω，说明固定探针已经自组装到金电极表面。电极表面在含有杂交探针、腺苷、启动探针与连接酶混合液中经过连接酶反应（曲线c）后，阻抗值继续升高至4 700 Ω，说明杂交探针已经顺利通过腺苷而连接到金电极上。曲线d是金表面经过滚环扩增反应后得到的交流阻抗谱，阻抗值为6 500 Ω，说明滚环扩增反应顺利进行，电极表面的DNA得以生长延长。标记AuNPs的检测探针与新生长出来的长链杂交后 （曲线e），阻抗谱半径显著增加，阻抗值达到14 500 Ω，表明标记AuNPs的检测探针很好地结合在电极表面，阻碍了电子的传递，实现对腺苷检测的信号放大作用；其阻抗的变化趋势也能从相应的循环伏安响应行为（图2B）中得到印证。

2.3 连接酶时间的优化

图2 传感界面逐步修饰过程的交流阻抗谱（A）与循环伏安响应图（B）：(a)裸金电极；(b)固定探针修饰电极；(c)连接酶反应产物修饰电极；(d)滚环扩增酶反应产物修饰电极；(e)AuNPs标记检测探针与滚环扩增酶反应产物杂交复合物修饰电极。所有电化学检测均在含0.1 mol/L KCl的5 mmol/L[Fe(CN)6]3-/4-溶液中进行Fig.2 Impedance spectra(A)and cyclic voltammogram(B)of the sensing interface with different modification processes.(a)Bare Au electrode;(b)capture probe assembled;(c)E.coli DNA ligase assembled electrode;(d) circular probe assembled;(e)AuNPs labeled probe assembled.All electrochemical test are carried out in 5 mmol/L [Fe(CN)6]3-/4-solutions containing 0.1 mol/L KCl

由于连接酶的反应深受孵育时间的影响，考察连接酶的孵育时间对腺苷检测的影响非常重要。图3为连接酶孵育时间与相对阻抗信号值的关系图，图中连接酶孵育时间分别为20 min、40 min、60 min、80 min和100 min，Z为有腺苷存在时的阻抗信号值，Z0为没有腺苷存在时的阻抗信号值。由图3可见，检测腺苷的信背比（Z/Z0）随着连接酶孵育时间的增加而增大，当连接酶的孵育时间为80 min时，对腺苷的检测信背比达最大值（2.5）。然后，当时间继续增加，信背比反而降低。原因是孵育时间超过80 min，背景信号快速上升，导致信背比下降。因此，连接酶的最佳孵育时间选用80 min。

图3 连接酶孵育时间与相对阻抗信号值关系图。Z为腺苷存在时的阻抗信号值，Z0为腺苷不存在时的阻抗信号值Fig.3 Effect on incubation time of E.coli DNA ligase.Z is the impedance value in the presence of adenosine,and Z0isthe impedance value in the absence of adenosine

2.4 特异性的考察

图4 工具酶级联扩增核酸适体传感方法用于腺苷和三种干扰物质（鸟嘌呤、胞嘧啶和尿嘧啶）检测的信背比柱状图Fig.4 Histogram of signal-to-background ratio(Z/Z0)for the enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensor.Z is the impedance value in the presence of analytes like adenosine,guanine,cytosine,and uridine.And Z0is the impedance value in the buffer solution(as blank)

为了考察该方法对腺苷检测的特异性，以鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶作为干扰物进行交流阻抗测试（图4），腺苷和三种同系物的浓度均为100 μmol/L。由结果可知，该传感器检测腺苷的信背比值（Z/Z0）为2.7，而加入鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶体系的信背比值接近1，即加入了鸟嘌呤、胞嘧啶、尿嘧啶的体系几乎无响应信号，即对腺苷的检测不产生干扰，表明该方法对腺苷有良好的选择性。

2.5 传感器的重现性

为了考察该文所发展的级联扩增核酸适体电化学传感器的重现性性能，将相同实验条件下制备的3支传感器分别结合浓度为100 μmol/L的腺苷样品，测试结果见表2，传感器的电化学阻抗响应值的标准偏差为±751 Ω，相对标准偏差为5.47%，表明该电化学传感器对腺苷的响应有良好的重现性。

2.6 腺苷的定量检测

为了考察该文所发展的级联扩增核酸适体电化学传感器的定量分析性能，将不同浓度的腺苷加入体系中，进行交流阻抗检测，实验结果如图5所示。在图5A中，传感器的阻抗响应值随着腺苷浓度的增加而增加，当腺苷浓度大于100 μmol/L时，电极的阻抗值反而减小。图5B为传感器对应的阻抗值与腺苷浓度的响应关系图，当腺苷浓度在2.0~100 μmol/L范围内时，传感器的阻抗值与腺苷的浓度呈线性关系 （见图5B的内插图），其线性方程为I(Ω)=71.80 c(μmol/L)+ 5 453.8，线性相关系数为r=0.986 3，且最低检测浓度为2.0 μmol/L，表明该方法对于腺苷样品的定量检测具有可行性。相对于较复杂的HPLC等仪器分析方法来说，该方法具有操作简单、快速、实用性强的优点，有望作为目标分子识别的一种通用传感界面的设计，在分子生物学和生物医学方面具有重要的应用价值。

表2 基于级联扩增核酸适体电化学传感器检测腺苷的重现性Tab.2 Reproducibility of the enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensor for adenosine

图5 级联扩增核酸适体电化学传感器检测不同浓度腺苷的交流阻抗图（A）和响应关系图（B）：图中腺苷浓度a至f分别为0 μmol/L、2.0 μmol/L、10 μmol/L、50 μmol/L、100 μmol/L、1 000 μmol/LFig.5 Impedance spectra(A)and response relationship of the enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensor for different concentrations of adenosine.The concentrations of adenosine from a to f are 0,2.0,10, 50,100,and 1 000 μmol/L

3 结论

该文联用连接酶和滚环扩增酶，利用核酸适体的特异性结合能力，建立了一种腺苷检测的新方法。在优化的实验条件下，腺苷浓度与阻抗信号值在2.0~100 μmol/L范围内呈线性关系，最低检测浓度为2.0 μmol/L。检测体系对腺苷表现出很好的选择性，腺苷同系物不干扰测定。该方法在设计上具有普遍应用性，可适用于任一已知核酸适体的设计，可扩展到其他目标分子的检测，因而具有更加广阔的应用前景。

[1]Zayats M,Huang Y,Gill R,et al.Label-free and reagentless aptamer-based sensors for small molecules[J].J. Am.Chem.Soc.,2006,128(42):13 666~13 667.

[2]He J L,Yang Y F,Shen G L,et al.Electrochemical aptameric sensor based on the Klenow fragment polymerase reaction for cocaine detection[J].Biosens.Bioelectron., 2011,26:4 222~4 226.

[3]Bini A,Minunni M,Tobelli S,et al.Analytical performances of aptamer-based sensing for thrombin detection [J].Anal.Chem.,2007,79(7):3 016~3 019.

[4]Cheng A K H,Ge B X,Yu H Z.Aptamer-based biosensors for label-free voltammetric detection of lysozyme [J].Anal.Chem.,2007,79(14):5 158~5 164.

[5]Li D,Shlyahovsky B,Elbaz J,et al.Amplified analysis of low molecular weight substrates or proteins by the selfassembly of DNAzyme-aptamer conjugates[J].J.Am. Chem.Soc.,2007,129(18):5 804~5 805.

[6]He X X,Ni X Q,Wang Y H,et al.Electrochemical detection of nicotinamide adenine dinucleotide based on molecular beacon-like DNA and E.coli DNA ligase[J]. Talanta,2011,83:937~942.

[7]Cheng C M,Wang J,Yang C,et al.Electrochemiluminescent assay for detection of extremely rare mutations based on ligase reaction and bead enrichment[J].Anal.Biochem.,2013,434:34~38.

[8]Yang L T,Fung C W,Cho E J,et al.Real-time rolling circle amplification for protein detection[J].Anal. Chem.,2007,79(9):3 320~3 329.

[9]Cho E J,Yang L T,Levy M,et al.Using a deoxyribozyme ligase and rolling circle amplification to detect a non-nucleic acid analyte,ATP[J].J.Am.Chem.Soc.,2005, 127(7):2 022~2 023.

[10]Wang Q,Yang L J,Yang X H,et al.Electrochemical biosensors for detection of point mutation based on surface ligation reaction and oligonucleotides modified gold nanoparticles[J].Anal.Chim.Acta,2011,688:163~ 167.

[11]Wu Z S,Jiang J H,Shen G L,et al.Highly sensitive DNA detection and pointmutation identification:An electrochemical approach based on the combined use of ligase and reverse molecular beacon[J].Human Mutation, 2007,28(6):630~637.

[12]Zhou L,Ou L J,Chu X,et al.Aptamer-based rolling circle amplification:a platform for electrochemical detection of protein[J].Anal.Chem.,2007,79(19):7 492~ 7 500.

[13]Ma C P,Wang W S,Yang Q,et al.Cocaine detection via rolling circle amplification of short DNA strand separated by magnetic beads[J].Biosens.Bioelectron.,2011,26: 3 309~3 312.

[14]Patolsky F,Katz E,Willner I.Amplified DNA detectuin by electrogenerated biochemilumiscence and by the catalyzed precipitation product on electrodes in the presence of the doxorubicin intercalator[J].Angew.Chem., 2002,114(18):3 548~3 552.

[15]He P,Shen L,Cao Y,et al.Ultrasensitive electrochemical detection of proteins by amplification of aptamernanoparticle bio bar codes[J].Anal.Chem.,2007,79 (21):8 024~8 029.

[16]Polslky R,Gill R,Kaganovsky L,et al.Nucleic acidfunctionalized Pt Nanoparticles:catalytic labels for the amplified electrochemical detection of Biomolecules[J]. Anal.Chem.,2006,78(7):2 268~2 271.

[17]Shlyahovsky B,Li D,Weixmann Y,et al.Spotlighting of cocaine by an autonomous aptamer-based machine[J]. J.Am.Chem.Soc.,2007,129(13):3 814~3 815.

[18]Weizmann Y,Beissenhirtz M K,Cheglakov Z,et al.A virus spotlighted by an autonomous DNA machine[J]. Angew.Chem.Int.Ed.,2006,45(44):7 384~7 388.

[19]Sharon E,Freeman R,Tel-Vered R,et al.Impedimetric or ion-Sensitive field-effect transistor(ISFET)aptasensors based on the self-assembly of Au anoparticle-functionalized supramolecular aptamer nanostructures[J]. Electroanal.,2009,21(11):1 291~1 296.

[20]Cao X D,Ye Y K,Liu S Q.Gold nanoparticle-based signal amplification for biosensing[J].Anal.Biochem., 2011,417(1):1~16.

[21]Grabar K C,Reeman R G,Hommer M B,et al.Preparation and characterization of Au colloid monolayers[J]. Anal.Chem.,1995,67(4):735~743.

[22]Wu Z S,Jiang J H,Fu L,et al.Optical detection of DNA hybridization based on fluorescence quenching of tagged oligonucleotide probes by gold nanopanicles[J].Anal. Biochem.,2006,353(1):22~29.

Enzyme cascade amplification based electrochemical aptamer sensing interface for adenosine detection

Wang Jun-xia,He Jing-lin*,Zeng Li-hong,Wu Ping,Zhu Shuang-li,Cao Zhong*
(Hunan Provincial Key Laboratory of Materials Protection for Electric Power and Transportation,School of Chemistry and Biological Engineering,Changsha University of Science and Technology,Changsha 410004,China)

A novel electrochemical aptamer sensing interface based on enzyme cascade amplification has been designed and constructed for detection of adenosine in this paper.In the presence of adenosine,the primer of the rolling circle amplification (RCA)was linked with the thiol-immobilized probe modified on gold electrode by E.coli DNA Ligase.The RCA was performed with pHi29 DNA polymerase to produce a long single strand,which was complementary to the circle template probe.Large amounts of gold nanoparticles labeled oligonucleotide probes were hybridized with the product of RCA.As a result,the impedance response of the sensing interface for recognition of adenosine was enhanced by the enzyme cascade amplification strategy.The proposed sensor possessed nice selectivity and reproducibility,and was applied to determination of adenosine samples with a linear range between 2.0 μmol/L and 100 μmol/L and a detection limit of 2.0 μmol/L.It can be seen that the strategy for design of the proposed sensing interface is expected to be used for any other targets detection as a general method.

sensing interface design;aptamer;enzyme cascade amplification;impedance;adenosine

国家自然科学基金(21105005,21275022,21075011)、湖南省教育厅科研基金(12B002)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NCET-10-0138)项目资助

*联系人,E-mail:jinglin_he2005@yahoo.com.cn(J.-L.He),zhongcao04@yahoo.com.cn(Z.Cao)