TiO2/Au复合膜酪氨酸酶修饰传感器检测双酚A

刘桂华，姚天明，柳 悦，谢 利，黄杉生

（上海师范大学生命与环境科学学院，上海201418）

TiO2/Au复合膜酪氨酸酶修饰传感器检测双酚A

刘桂华，姚天明，柳 悦，谢 利，黄杉生*

（上海师范大学生命与环境科学学院，上海201418）

基于TiO2和金纳米粒子研制了一种新型双酚A酶生物传感器。研究表明金纳米粒子与具有生物相容性的纳米TiO2组合，可有效的保持酶的生物活性，具有协同效应。制备的TiO2/Au复合膜酪氨酸酶修饰传感器对环境雌激素双酚A（BPA）的灵敏、快速的电流响应。该传感器对BPA的响应的线性范围为2×10-7～2.8×10-6mol/L，检测限为5×10-8mol/L(S/N=3)。电极用于实际样品的测定，结果满意。

金纳米粒子；酪氨酸酶；二氧化钛；双酚A；酶生物传感器

0 引言

酚类环境雌激素指的是那些具有类雌激素活性，且同时具备酚类结构的环境内分泌干扰物[1~2]，已经被发现的主要有双酚A(BPA)、辛基酚、壬基酚、和2,4-二氯苯酚[3]等。由于环境雌激素对人类及其他哺乳动物的内分泌系统产生严重的影响，具有一定程度的毒性作用[4]，尤其是其中具有致癌，致畸，致变 “三致”潜在危险的BPA[5]，它不仅大量地存在于自然环境中[6]，同时作为工业生产中广泛使用的原材料，与人类的工作和生活紧密相关[7]，因此建立快速、准确及可靠地测定BPA的方法意义深刻[8]。

金属氧化物纳米粒子和金属纳米粒子都已越来越广泛地用来修饰电极。在大量的新型纳米材料之中，TiO2因为在紫外光照射下可以催化降解部分有机污染物而广泛受到关注。实验室可制备多种形态的纳米TiO2，如：纳米粒子[9]、纳米纤维[10]和纳米管[11]等。作为一种半导体材料纳米TiO2，有着良好的电子传导能力，大的比表面积，催化降解效应和生物相容性，在现今各种形态的TiO2都被用来作为电极的修饰材料制备生物传感器[12~15]。

金纳米粒子（AuNPs）作为被最频繁使用和最广泛研究的一种纳米材料，也大量的在构建生物传感器时使用。其出色的电子传递能力和极佳的生物相容性都为大众熟知，这些特性使得金纳米粒子可以构建出色，稳定且保持酶活性的固载界面。但小颗粒的物质在水相中十分容易团聚在一起，从而导致各种性能的降低。在该工作中，纳米金粒子和TiO2通过壳聚糖被均匀分散，TiO2的存在可以有效地防止金纳米粒子发生团聚。而且二者都具有良好的生物相容性，结合在一起能有效的保持酶的生物活性，发挥良好的协同作用。研制的TiO2/Au复合膜酪氨酸酶修饰传感器用于环境雌激素双酚A（BPA）的检测，具有令人满意的灵敏度、稳定性和重现性。

1 实验部分

1.1 主要试剂与仪器

酪氨酸酶 （Tyr,5370 U/mg，Sigma公司，美国），双酚A(BPA，成都化工有限公司)，壳聚糖(Chits)、氯金酸（HAuCl4）购于上海化学试剂有限公司；[Fe(CN)6]4-/3-溶液由定量的铁氰化钾，亚铁氰化钾和氯化钾配制；磷酸盐缓冲溶液由0.1 mol/L的NaH2PO4，Na2HPO4和KCl调配而成；以上使用试剂均为分析纯。实验用水为Milli-Q系统制备的超纯水（＞18 MΩ·cm）。

电化学实验均在CHI 760 C型电化学工作站（上海辰华仪器有限公司）上进行。采用三电极系统，修饰电极为工作电极，铂电极为对电极，甘汞电极为参比电极。紫外-可见（UV-Vis）光谱实验采用UV-2100型紫外-可见分光光度计（上海优尼科仪器有限公司）；场发射扫描电子显微镜（FESEM）图由Hitachi S-4800型扫描电镜得到；透射电子显微镜（TEM）图由JEOL-JEM200CX型透射电镜得到。

1.2 TiO2材料制备

0.160 0 g四氟化钛（TiF4）粉末准确加入到40 mL叔丁醇中，等到TiF4粉末完全溶解后，转移到50 mL的水热釜中，放入160℃烘箱3 d。得到的白色粉体经乙醇洗涤、4 000 r/min离心3次，放入100℃的烘箱下烘干，最后在设定温度下焙烧2 h。升温速率为2℃/min。Au纳米材料的制备按文献所述方法制备[16]。

1.3 电极的表面处理与修饰

玻碳（GCE）电极分别用1.0、0.3、0.05 mm的氧化铝粉末在麂皮上打磨抛光，直至产生一个光亮、平滑的表面。电极分别置于超纯水，无水乙醇、超纯水里超声清洗3 min后，用氮气将其表面吹干。将5μL含有1:1的金溶胶和2 mg/mL的TiO2壳聚糖（w=0.5%）溶液滴加到上述已经处理好的光洁的电极表面，放入干燥器中，形成一层TiO2/Au薄膜。随后取2 μL的酪氨酸酶（2 mg/mL）滴加到处理好的电极表面，置于冰箱4℃保存待用。所制备的电极标记为Tyr/Au-TiO2/chits/GCE。

2 实验结果与讨论

2.1 材料表征

采用场发射扫描显微镜对合成的TiO2纳米粒子进行了表征（图1a），得到的TiO2表面粗糙，且存在许多空穴，具有较大的比表面积。图1b为金纳米粒子透射电子显微镜图，由图可见，金纳米粒子的粒径约为8～20 nm。小粒径的AuNPs可以容易的分布在TiO2表面的空穴中，有利于二者结合发挥协同作用。

图1 (a)TiO2场发射扫描显微镜图和(b)AuNPs的透射电镜图Fig.1 FESEM image of TiO2（a）and TEM image of AuNPs(b)

2.2 电化学行为表征

循环伏安法（CV）是一种表征电子传递能力电化学检测方法，可以明显的表征电极是否修饰成功。图2是修饰电极制备过程在[Fe(CN)6]4-/3-溶液中的CV图。

图2 (a)裸GCE和(b)TiO2-Au/chits/GCE,(c)Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在1 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-（0.1 mol/L KCl）溶液中的循环伏安曲线Fig.2 CVs of GCE(a),TiO2-Au/chits/GCE(b),and Tyr/TiO2-Au/chits/GCE(c)in 1mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-containing 0.1 mol/L KCl

由图2可见，裸GCE(a)在[Fe(CN)6]4-/3-溶液中呈现出一对良好峰形的准可逆氧化还原峰 （图2曲线a）。在其表面修饰了金溶胶和2 mg/mL的TiO2壳聚糖后，TiO2-Au/chits/GCE的峰电流有略微降低(图2曲线b)，这说明电极表面TiO2-Au修饰成功，TiO2-Au层的存在部分占据了GCE表面的导电位点。当在TiO2-Au/chits/GCE上修饰了酪氨酸酶Tyr后，Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的峰电流明显变小(图2曲线c)，因为生命物质Tyr导电性比较差，也表明了Tyr成功的组装到了修饰电极上。

2.3 电化学交流阻抗表征

用交流阻抗法（EIS）表征了电极在修饰过程中的交流阻抗曲线（图3）。曲线(a)是裸GCE电极的交流阻抗曲线，由图可知在所有的频率范围内都近乎是一条直线。图中的(b)和(c)分别对应TiO2-Au/chits/GCE和 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的交流阻抗曲线。可以发现随着修饰层数的增加，TiO2-Au/chits的存在使得[Fe(CN)6]4-/3-在电极表面的电子转移阻力增大（b）。当电极修饰了Tyr后的阻抗图，阻抗半圆明显增大(c)，说明生命物质Tyr的存在更加大了电极表面电子转移的阻力。EIS的实验结果与CV表征的结果高度一致，因此，可以认为用此法成功制备了Tyr/TiO2-Au/chits/GCE电极。

图3 GCE(a)，TiO2-Au/chits/GCE(b),和Tyr/TiO2-Au/chits/GCE(c)在10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-（0.1 mol/L KCl）溶液中的交流阻抗图Fig.3 EIS of GCE(a)TiO2-Au/chits/GCE(b)and Tyr/TiO2-Au/chits/GCE(c)in 10 mmol/L[Fe(CN)6]4-/3-containing 0.1 mol/L KCl

2.4 修饰电极BPA的响应

在含5.0×10-5mol/L BPA的PBS(pH=8.0)溶液中，裸GCE、TiO2-Au/chits/GCE和Tyr/TiO2-Au/ chits/GCE的循环伏安响应，见图4。GCE（a）和TiO2-Au/chits/GCE（b）没有明显的氧化还原峰，而Tyr/TiO2-Au/chits/GCE（c）在0.15 V处出现一个明显的氧化峰，说明在修饰了酪氨酸酶（Tyr）存在情况下电极对BPA有显著的响应。

2.5 溶液pH的影响

图5 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在pH值为5.0,6.0,7.0,8.0和9.0 PBS中循环伏安曲线。内插图：pH值与氧化电位E0x的线性关系。扫速:100 mV/sFig.5 Effect of pH value of medium on CVs of Tyr/TiO2-Au/chits/GCE Inset:plot of potential versus the pH. Scan rate:100 mV/s

酶的活性对酶生物传感器至关重要，其中溶液的pH值对酶活性影响直接会导致电化学行为变化。通常，氧化还原的电位与溶液的pH值有关。图5为Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在不同pH值PBS中的循环伏安曲线。从图上可以看到在pH值5.0~9.0之间，Tyr都有催化BPA所产生的氧化峰，且随着pH值的增大，氧化峰电位发生正移。并且其氧化峰的电位与溶液的pH值成线性关系（左上插图），线性的斜率为-51.8 mV/pH（r= 0.995 0）。接近-57.6 mV/pH的理论单质子转移的电极反应。选择pH=8为后续实验的溶液条件。

2.6 扫描速度对循环伏安特性的影响

图6是Tyr/TiO2-Au/chits/GCE不同扫速的循环伏安曲线。从图中可以发现，氧化峰电流随着扫速的增加而增加，并且在扫速50~250 mV/s范围内，氧化峰的峰电位基本不变，且氧化峰电流与扫速成线性关系。线性关系如左上插图所示，表明Tyr催化BPA这一反应是表面控制的电极反应过程，与文献报道一致。同时这也表明修饰材料及Tyr都已固定到了电极上，并伴随有电子转移。

2.7 计时库仑法

电极有效表面积可以对计时库仑法图（如图7所示），通过Anson[17]公式从Q与t1/2的线性关系计算得到：

式中，A是工作电极的有效表面积，c是物质的浓度，D是扩散系数，Qdl是能通过背景物质估算的双层电荷，Qads为法拉第电荷。其他符号都是常数。基于Q和t1/2之间的斜率关系，当c，D和n都知道时，A能被计算出来。计时库仑法实验是在含有1 mmol/L KCl的0.1mmol/L K3[Fe(CN)6]溶液中进行的（图7）。K3[Fe(CN)6]的扩散系数是7.6×10-6cm2/s[17]。由此可以计算出电极的有效表面积A为 0.000 81 cm2(裸GCE)和0.002 90 cm2(Tyr/TiO2-Au/chits/GCE)。通过比较电极在修饰前后有效表面积的变化，发现Tyr/TiO2-Au/chits/GCE有更好的有效表面积，几乎是裸GCE的4倍。说明Tyr/TiO2-Au/chits/GCE可以提供更多的有效位点，从而提高响应信号。

图6 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在PBS(pH=8.0)中不同扫速的循环伏安曲线：50,100,150,200,250 mV/s（从内至外）。内插图：峰电流与扫速的线性关系Fig.6 Effect of scan rate on CVs of Tyr/TiO2-Au/chits/GCE in PBS(pH8.0)Inset:plot of peak current versus scan rate

图7 裸GCE（a）和Tyr/TiO2-Au/chits/GCE（b）在0.1 mmol/L K3[Fe(CN)6]（1 mmol/L KCl）的Q-t曲线插图：（a）裸GCE和（b）Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的Q与t1/2的线性关系Fig.7 Plot of Q and t1/2of(a)bare GCE and(b)Tyr/TiO2-Au/chits/GCE in 0.1 mmol/L K3[Fe(CN)6]solution containing 1 mmol/L KCl.Inset:Relationship of Q and t1/2of(a)bare GCE and(b)Tyr/TiO2-Au/chits/GCE

2.8 计时电流响应

图8是Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在0.2 V的工作电位下，向PBS(pH=8.0)中连续加入BPA的it曲线。随着BPA浓度的不断增加，氧化电流随之慢慢增加并很快达到稳态电流。内插图反映了该传感器在不同BPA浓度下对催化电流的线性校正关系，Tyr/TiO2-Au/chits/GCE对BPA的检测浓度范围为2×10-7~2.8×10-6mol/L，线性相关系数r=0.996 7(n=14)，检测限为5×10-8mol/L（信噪比S/N=3）。

图8 Tyr/TiO2-Au/chits/GCE在PBS(pH=8.0)中连续加入BPA的计时电流响应曲线(工作电位:0.2 V)。右上插图:响应电流与BPA浓度的校正曲线Fig.8 I-T of the Tyr/TiO2-Au/chits/GCE at 0.2 V of successive addition of BPA in a stirred PBS(pH=8.0). Inset:plot of the linear calibration curves

2.9 重现性、稳定性、抗干扰性和实际样品检测

用相同制备方法所制备的5支Tyr/TiO2-Au/chits/GCE对同一浓度 BPA溶液 （5.0×10-5mol/L）进行测定，所得到电流响应值的相对标准偏差为2.26%。修饰电极对同一浓度BPA溶液（5.0×10-5mol/L）连续测定14 d，14 d后的电流响应值仍保持原来的88%以上。表明该修饰电极的重现性和稳定性较好。维持试液中BPA浓度为5.0×10-5mol/L，考察了酚类物质，如：2,4,6三氯苯酚，1-亚硝基-2-萘酚，邻氨苯酚，2,4二氯苯酚，苯酚，邻氨二甲酸二正辛酯对Tyr/TiO2-Au/chits/ GCE检测BPA的干扰，发现1-亚硝基-2-萘酚，邻氨苯酚，2,4二氯苯酚，邻氨二甲酸二正辛酯对检测几乎不存在干扰，在检测BPA时只存在很小的偏差（＜10%）。而2,4,6三氯苯酚和苯酚所产生的峰电位不同于BPA检测的峰电位。同时也考察了常见无机离子如：Na+、Ca2+、Mg2+、Fe3+、Al3+、Zn2+、、和对检测的干扰，发现对检测并不产生影响。说明Tyr/TiO2-Au/chits/GCE有很好的抗干扰能力，对BPA有着很好的选择性。实际样品的检测和回收率测试结果列入表1。

表1 样品检测及回收率测定Tab.1 Determination of different samples and recovery

3 结论

研制的Tyr/TiO2-Au/chits/GCE的新型酪氨酸酶传感器，对BPA有灵敏的电流响应，电极的重现性和稳定性良好。为BPA的检测提供了一个简单、廉价、可供选择的方法。

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Determination of bisphenol A based on nano-TiO2/Au tyrosinase composite biosensor

Liu Gui-hua,Yao Tian-ming,Liu Yue,Xie Li,Huang Shan-sheng*
(Life and Environmental Sciences College,Shanghai Normal University,Shanghai 201418,China)

A novel enzyme biosensor for bisphenol A(BPA)was fabricated based on Au nanoparticles and titanium dioxide nanoparticles (TiO2).The study revealed that the combination of Au nanoparticles and titanium dioxide nanoparticles with biocompatibility showed the synergistic effect on the response of BPA at this electrode,resulting in a highly sensitive,selective,stable,fast response to BPA.The method showed good linearly for 2×10-7～2.8×10-6mol/L BPA with a detection limit of 5×10-8mol/L (S/N=3)under the optimal conditions.The performance of the electrode was verified by the determination of BPA.

Au nanoparticle;tyrosinase;titanium dioxide;bisphenol A;enzyme biosensor

*通讯联系人,E-mail:sshuang@shnu.edu.cn