垂丝海棠花粉贮藏特性研究

史锋厚，范蓉蓉，周 婷，沈永宝

（南京林业大学 森林资源与环境学院，江苏 南京 210037）

在植物的常规育种工作中，人工授粉常需提前采集花粉并贮藏花粉。花粉贮藏可以解决杂交亲本花期不遇产生的时间差问题，同时能解决远距离人工辅助授粉的问题。花粉活力主要受到植物遗传特性的制约，但贮藏条件也会影响花粉的寿命[1-2]。影响花粉贮藏效果的条件主要为贮藏温度和花粉含水量，且各自的影响效果存在差异[3-6]。海棠为我国传统观赏植物，关于其花粉贮藏和萌发的研究报道并不多见。因此，文中以垂丝海棠Malus halliana为研究对象，对其花粉萌发率进行了测定，分析了不同贮藏条件对花粉活力的影响情况，以期为垂丝海棠花粉的保存和利用提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 花粉采集

2010年4月上旬，在南京林业大学校园内采集垂丝海棠的花粉。从5株植株中剪取着生花芽较多的枝条约20枝，带回实验室水培催花。待花瓣张开时，用镊子拨出并抖动花药，用硫酸纸收集花粉并将花粉充分混合以待用。

1.2 花粉干燥

花粉干燥采用室内自然风干法。将收集的花粉均匀平铺于硫酸纸表面，每隔1 h搅拌1次花粉，促使其中的水分均匀散失。分别风干3和6 h后，获得不同含水量的花粉样品，以未风干的花粉作为对照。按照高芬等人[1]所用的烘干法测定花粉含水量。

1.3 花粉贮藏

将不同含水量的花粉分别密封于10 mL的离心管中，并分别置于室温（25 ℃）、4 ℃、－18 ℃、－38 ℃的冰箱中保存，每隔5 d测定各处理花粉的萌发率，持续测定30 d。

1.4 花粉萌发试验

花粉萌发试验采用琼脂、蔗糖、硼酸固体培养基。为了优选最佳培养基，采用了单因素梯度试验设计，各处理所用花粉培养基的具体配方详见表1。

表1 花粉培养基配方Table 1 Formula of pollen media %

培养时将花粉均匀地散落在盛有培养基的凹形载玻片上，置于底部带有湿润滤纸的培养皿内，在25 ℃恒温箱内培养6 h后，置于显微镜下观察花粉萌发情况，每份样品设3个重复，每个重复观察3个视野，以花粉管长度超过花粉直径作为萌发标准，统计萌发率。

2 结果与分析

2.1 蔗糖和硼酸对花粉萌发的影响

先以0.6%琼脂＋不同浓度蔗糖＋1.0%硼酸作为培养基进行新鲜花粉的萌发试验，再以0.6%琼脂＋10%蔗糖＋不同浓度硼酸为培养基进行新鲜花粉萌发试验，各处理花粉萌发结果见表2。由表2 可知，培养基中添加蔗糖对花粉萌发的促进作用达极显著水平（P＜0.01），花粉萌发率随着蔗糖浓度的增大呈先上升后下降的变化趋势；当培养基中的蔗糖浓度为10%时，花粉萌发率最高，为对照的4倍；当蔗糖浓度超过10%时，花粉萌发率则显著下降。

表2 蔗糖和硼酸对花粉萌发的影响†Table 2 Effect of sucrose and H3BO3 on pollen germination %

在0.6%琼脂＋10%蔗糖配方的基础上，在培养基中添加不同浓度的硼酸进行新鲜花粉萌发试验，各处理的花粉萌发率亦见表2。培养基中添加硼酸可以极显著地提高花粉的萌发率（P＜0.01）；在添加了不同浓度硼酸的培养基后，各处理花粉萌发率之间的差异达到了显著水平。硼酸浓度为2.0%时，花粉萌发率高达81%。综合分析可知，宜用0.6%琼脂＋10%蔗糖＋2.0%硼酸的配方培养基作为垂丝海棠花粉萌发培养基。

2.2 自然干燥对花粉含水量和活力的影响

在自然干燥过程中，花粉含水量下降，花粉活力随之发生变化（见表3）。经不同时间自然干燥处理后，花粉萌发率之间的差异达到了极显著水平（P＜0.01）。当花粉含水量降至10.35%时，花粉萌发率下降3个百分点，即自然干燥3 h后花粉仍能保持较高的活力；而当其含水量下降至8.72%时，花粉活力却显著下降，此时花粉的萌发率仅为58%。上述结果说明：花粉萌发率随其含水量的下降而降低，但当含水量的下降幅度不大时，花粉活力仍能保持较高水平；但自然干燥时间较长时，花粉萌发率却显著降低。因此，新鲜花粉采集后，应防止过度失水，避免花粉活力明显下降。

表3 干燥时间对海棠花粉活力的影响Table 3 Effect of drying time on pollen vigor in Malus halliana

2.3 不同贮藏条件对花粉萌发的影响

将不同含水量的花粉分别贮藏在不同温度条件下，各处理花粉萌发率的变化情况如图1～3所示。对不同贮藏条件下海棠花粉的萌发率进行方差分析与多重比较，结果分别见表4与表5。

图1 新鲜垂丝海棠花粉萌发率的变化情况Fig.1 Variation of germination rate of fresh pollens in Malus halliana

图2 干燥3 h后的垂丝海棠花粉萌发率的变化情况Fig.2 Variation of germination rate of pollens dried for three hours in Malus halliana

图3 干燥6 h后的垂丝海棠花粉萌发率的变化情况Fig.3 Variation of germination rate of pollens dried for six hours in Malus halliana

在不同贮藏时间和贮藏温度条件下，新鲜花粉的萌发率随贮藏时间的延长而呈现出逐渐下降的变化趋势（如图1）；不同贮藏温度、不同贮藏时间下花粉萌发率之间的差异均达到了极显著水平，贮藏温度和时间之间具有极显著的交互作用（见表4）。室温贮藏的花粉其萌发率下降速度最快，贮藏5 d时，花粉萌发率已下降52个百分点，贮藏15 d时已完全不能萌发。贮藏于4 ℃和－18 ℃温度条件下的花粉其萌发率具有相同的变化趋势；但贮藏于4 ℃温度条件下的花粉萌发率其下降幅度更大；贮藏在－38 ℃温度条件下的花粉，在贮藏前5 天花粉的萌发率降低了13个百分点；继续贮藏至30 d时花粉萌发率的变化不大。

在不同贮藏温度条件下，含水量为10.35%的花粉其萌发率的变化情况见图2。贮藏温度和贮藏时间对花粉萌发的影响均达极显著水平，贮藏温度和时间之间具有极显著的交互作用（见表4）。分别贮藏于室温和4 ℃条件下的花粉其萌发率持续下降；分别贮藏于－18 ℃和－38 ℃条件下的花粉其萌发率的变化趋势基本一致。花粉在室温中贮藏5 d，其萌发率降低33个百分点；贮藏至30 d时其萌发率已降至0。在4 ℃贮藏环境中，花粉萌发率均匀下降。在－18 ℃和－38 ℃温度条件下贮藏前10 d，花粉萌发率的变化情况基本相似；贮藏10 d后，贮藏于－38 ℃条件下的花粉其萌发率的降幅较小，贮藏至30 d时其萌发率仍有67%。

自然干燥6 h后，花粉萌发率已降至58%，贮藏于各温度条件下的花粉其萌发率均呈下降趋势（图3）。不同贮藏温度之间、不同贮藏时间之间花粉萌发率的差异均达极显著水平，贮藏温度和时间之间具有极显著的交互作用（表4）。室温贮藏前10 d，花粉萌发率持续下降，室温贮藏至10 d时，萌发率仅为2%。贮藏于－18℃和－38 ℃条件下的花粉其萌发率的变化趋势和变化幅度相似，贮藏至30 d时萌发率已分别降至35%和39%。贮藏5 d后，贮藏于4 ℃条件下的花粉其萌发率降低19个百分点；而后花粉萌发率均匀下降，贮藏至30 d时，花粉萌发率仅为12%。

表4 不同干燥时间与不同贮藏条件下花粉萌发率的方差分析结果†Table 4 Variance analysis of pollen germination rates dried for different duration under different storage conditions

表5 各处理花粉萌发率的多重比较结果Table 5 Multiple comparisons of pollen germination rates in different treatments

3 讨论与结论

3.1 蔗糖和硼酸对花粉萌发的影响

花粉离体萌发培养是花粉活力检验的常用方法，具有简单、迅速、定量的特点[7]。离体培养基一般由蔗糖、琼脂和硼酸组成，蔗糖和硼酸的浓度对花粉萌发具有不同程度的影响[4，8]。在本实验中，培养基中添加蔗糖可以显著促进花粉萌发，这与有关新疆野苹果M.sieversii的研究结论一致[4]，蔗糖可以为花粉萌发和花粉管生长提供营养物质，同时能维持花粉与培养基之间的渗透平衡[9]。垂丝海棠花粉萌发培养基中蔗糖的最佳浓度为10%，这与樊新民等人[3]和张鲜鲜等人[10]的研究结论相符。蔗糖具有浓度效应，当超过一定浓度时，其表现出抑制作用[8]，花粉萌发率反而会降低，而高浓度蔗糖可引起花粉质壁分离，抑制花粉萌发[11]。

硼酸是花粉萌发时必需的微量元素，可以促进糖的吸收和代谢，增加氧气的含量和吸收量，促进果胶物质的合成，有利于花粉萌发和建造花粉管[12]。本实验结果证实，培养基中添加硼酸有利于花粉萌发，促使花粉萌发的适宜硼酸浓度为1.5%～2.5%，其中浓度为2.0%的硼酸对花粉萌发的促进效果最佳，这与张鲜鲜等人[10]的研究结论相似。综合试验结果来看，应选择0.6%琼脂＋10%蔗糖＋2.0%硼酸的培养基作为垂丝海棠花粉萌发检测的基本培养基。

3.2 花粉贮藏特性

花粉贮藏条件对于花粉活力的保持具有重要作用，影响花粉寿命的关键因子是花粉含水量和贮藏温度，一般认为，干燥处理、低温是保存花粉的必要前提[13]。不同花粉贮藏所需的最佳含水量和贮藏温度存在差异，如室内凉干24 h的苹果M.domestica花粉在常温条件下贮藏的时间不能超过1周，在－20 ℃条件下贮藏30 d的花粉其萌发率高于90%[6]；海棠M.spectabilis花粉贮藏效果的温度条件依次为超低温（－196 ℃）＞0 ℃＞－20 ℃＞常温[3]；新疆野苹果花粉于4 ℃温度条件下贮藏的效果较好[4]；银杏Ginkgo biloba花粉含水量在6.7%～8.9%时，贮存温度在6 ℃以下其萌发率均较高[14]；沙田柚Citrus maximacv.Shatian花粉低温贮藏的适宜含水量为11.2%～13.5%[15]；蔗茅Erianthus ru fi pilus花粉含水量在低于10%时才能较长时间地保持花粉活力[16]。因此，不同种类的花粉在贮藏时需要寻求其最佳花粉含水量和适宜贮藏温度范围。

本实验中，不同含水量的垂丝海棠花粉贮藏在4种温度环境中，各处理花粉萌发率呈现出不同的下降趋势，但各处理花粉萌发率的变化存在显著差异，贮藏温度和花粉含水量对于花粉活力的保持具有显著的交互作用。在各含水量梯度内，垂丝海棠花粉贮藏能力的排序均为：室温＜4 ℃＜－18 ℃＜－38 ℃，这与有关苹果混合花粉的研究结果一致[5]。室温贮藏不利于花粉活力的保持，花粉在短期贮藏时间内均丧失活力。－38 ℃低温环境更有利于花粉活力的保持，其原因在于低温可抑制物质代谢，减弱酶活性，降低呼吸作用[7]。适度降低花粉含水量有利于花粉活力的保持，但花粉失水过多则会导致花粉活力快速下降。当花粉含水量为10.35%时，与新鲜花粉相比，花粉仍然具有较高活力，且在适宜的贮藏温度条件下可以长时间保持其较高活力；当花粉自然干燥6 h时，花粉萌发率显著下降，花粉活力在贮藏过程中丧失较快。

参考文献：

[1] 高 芬,沈永宝.南京椴花粉贮藏寿命的研究[J].南京林业大学学报,2009,33(2):141－144.

[2] 尹佳蕾,赵惠恩.花粉生活力影响因素及花粉贮藏概述[J].中国农学通报,2005,21(4):110－113．

[3] 樊新民,牛建新,孙爱新,等.榆叶梅和海棠花粉萌发率的测定及超低温保存方法[J].湖北农业科学,2004,(6):65－66.

[4] 杨 磊,廖 康,许 正,等.新疆野苹果花粉活力的研究初报[J].中国农学通报,2009,25(23):335－338.

[5] 曲复宁,林 涛,王炳硕,等.苹果花粉贮藏性和授粉能力测定[J].中国果树,1997,(l):3－5.

[6] 刘存宏,李 华.苹果花粉贮藏试验[J].山西果树,1997,(4):7.

[7] 王钦丽,卢龙斗,吴小琴,等.花粉的保存及其生活力测定[J].植物学通报,2002,19(3):365－373.

[8] 徐臣善.苹果花粉萌发生理影响因子的研究[J].中国农学通报,2011,27(31):163－167.

[9] 潘瑞炽.植物生理学[M].北京:高等教育出版社,2001.

[10] 张鲜鲜,赵 静,李 欣,等.不同品种(系)海棠花粉生活力的比较测定[J].山东农业科学,2010,(2):27－30.

[11] Wang Q L, Lu LD, Wu XQ,et al.Pollen storage and viability determination [J].Chin Bull Bot, 2002,19(3):365－372.

[12] 蒲光兰,周兰英,李瑾宵,等.温度、蔗糖和硼酸对麻疯树花粉离体萌发的影响[J].西北林学院学报,2011, 26(3): 55－58.

[13] 张益清.花粉的寿命与贮藏[J].植物杂志,1986,(1):34.

[14] 徐刚标,何 方,黄晓光.银杏种质离体保存的研究Ⅰ 银杏花粉贮存[J].中南林学院学报,2000,20(1):27－30.

[15] 薛妙男,刘华英,饶桂荣,等.沙田柚花粉低温贮藏的研究[J].广西植物,2000,20(4):367－370.

[16] 李富生,林位夫,何顺长.不同无性系蔗茅抽穗开花特性的观察和花粉贮藏条件的研究[J].植物生理学通讯,2005,41(2):171－174.