水飞蓟蛋白组分的理化特性研究

朱淑云 董 英 肖 香 张珊珊 秦云云

（江苏大学食品与生物工程学院，镇江 212013）

水飞蓟［Silybum Marianum（L.）Gaertn］为菊科水飞蓟属草本植物，原产于地中海沿岸，现在欧洲、北美洲、亚洲、非洲等地区广泛栽培，在我国的陕西、黑龙江、辽宁、江苏、湖北等省也有种植。水飞蓟作为一种传统的药用植物，主要利用其籽实。水飞蓟籽由壳和仁两部分组成，其药用成分水飞蓟素主要存在于壳中，籽仁中主要含蛋白质、油脂和淀粉等［1－2］。

目前国内外对水飞蓟的研究主要集中在对水飞蓟素的开发利用上，对水飞蓟蛋白的研究较少［3－5］。作者前期研究发现，水飞蓟籽仁脱脂粉中蛋白质质量分数高达47.23%，水飞蓟蛋白主要以清蛋白为主，占总蛋白的42.94%，它的质量对水飞蓟蛋白质的品质、特性有着重要影响。球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白在总蛋白中的质量分数分别为10.1%、4.36%和0.61%［6］。有关水飞蓟各蛋白组分的理化性质和功能特性的研究尚未见报道。

本试验以经过脱脂处理的水飞蓟籽仁为原料，研究水飞蓟蛋白组分的理化性质与功能特性，为将水飞蓟蛋白开发为新资源食品奠定基础，也为提高水飞蓟资源综合利用率提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

水飞蓟籽仁:江苏中兴药业有限公司提供，通过低温加压溶剂萃取技术脱脂，将脱脂水飞蓟粉过80目筛备用；大豆油:市售；其他试剂均为分析纯。

1.2 主要仪器与设备

WFJ7200可见光分光光度计:尤尼柯上海仪器有限公司；ALPHAI－4/2－4型冷冻干燥机:德国CHRIST公司；Agilent 1100液相色谱:美国安捷伦公司；DYY－Ⅲ23A型电泳槽和ECP300三恒多用电泳仪:北京市六一仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 水飞蓟蛋白组分的制备

参考朱淑云等［6］的方法，分别提取水飞蓟清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，所得上清液经中和、浓缩后冷冻干燥得到各蛋白样品（球蛋白需透析48 h）。

1.3.2 水飞蓟蛋白组分的SDS－PAGE电泳分析

采用SDS－PAGE不连续缓冲系统进行电泳［7］。使用垂直板电泳槽，分离胶浓度为12%，浓缩胶浓度为5%，采用考马斯亮蓝R－250染色。

1.3.3 水飞蓟蛋白组分的氨基酸组成分析

采用酸水解法［8］。

1.3.4 水飞蓟蛋白组分营养特性分析

1.3.4.1 必需氨基酸与总氨基酸之比

采用Chavan等［9］报道的方法计算必需氨基酸比例:

E/T＝Ile＋Leu＋Lys＋Met＋Cys＋Phe＋Tyr＋Thr＋Val＋His/Ala＋Asp＋ Arg＋Gly＋Glu＋Ile＋Leu＋Lys＋Met＋Cys＋Phe＋Tyr＋Pro＋Ser＋Thr＋Val＋His×100%

1.3.4.2 氨基酸评分（AAS）

根据FAO/WHO1993年建议的每克氨基酸评分标准模式进行营养价值评定，氨基酸评分按下式计算:

1.3.4.3 蛋白质效率比（PER）［10］

根据以下方程计算蛋白质效率比:

式中:PER为蛋白质效率比；HLeu为Leu在蛋白中的质量分数；HPro为Pro在蛋白中的质量分数；HTyr为Tyr在蛋白中的质量分数；HMet为Met在蛋白中的质量分数；HHis为His在蛋白中的质量分数。

1.3.4.4 蛋白质的体外消化率

称取0.2 g蛋白样品，溶解于20 mL pH 1.5的HCl溶液中，加入胃蛋白酶（1∶8 000 U/g蛋白），置于37℃恒温水浴反应2 h，调节至pH 7.0，加入胰蛋白酶（1∶8 000 U/g蛋白）再恒温水浴消化2 h，加入等体积10%三氯乙酸终止反应，静置10 min后离心分离，同时做空白。氮的含量采用凯氏定氮法测定。体外消化率的计算公式如下:

1.3.4.5 蛋白质消化率校正的氨基酸分数（PDCAAS）［11］

PDCAAS按下式计算:PDCAAS＝最小氨基酸评分分数×蛋白体外消化率

1.3.5 水飞蓟蛋白组分的功能特性

1.3.5.1 溶解性的测定［12］

配制质量分数为1%的蛋白溶液，分别用0.5 mol/L HCl或 NaOH调节至 pH 2.0～9.0，室温下搅拌30 min，4 000 r/min离心20 min。用考马斯亮蓝比色法测定上清液中的蛋白含量。将适量蛋白粉完全溶解在一定pH的水溶液中，用考马斯亮蓝比色法测得的蛋白含量作为总蛋白含量。用以下公式计算蛋白的溶解性（PS）。

1.3.5.2 持水性和持油性的测定［13］

取0.2 g蛋白样品加2.0 mL水或大豆油置于离心管中，混匀1 min后，在室温下静置30 min，然后以4 000 r/min离心30 min，测量上清液体积，结果以每克蛋白质所吸水或油的体积表示（mL/g）。

1.3.5.3 起泡性及泡沫稳定性的测定［14］

配制质量分数为1%的蛋白样品溶液，调节至pH 7.0，室温搅拌20 min后，转入匀浆机高速搅打2 min，记录搅打停止时泡沫体积和停止后30 min时的泡沫体积。

1.3.5.4 乳化性及乳化稳定性的测定［15］

用pH 7.0的磷酸盐缓冲液配制6 mL 0.5%的蛋白质悬浮液，分别加入2 mL大豆油，高速匀浆乳化1 min，立即用微量取样器从溶液底部吸取20μL乳浊液，加到5 mL 0.1%SDS溶液中，于500 nm测定吸光值A0，静置10 min后重新从乳浊液底部取样测定吸光值得At。

式中:t为2次测定乳化性的时间间隔（t＝10）。

1.4 数据处理

试验数据均进行3次重复试验，并取平均值。

2 结果与分析

2.1 水飞蓟蛋白组分的SDS－PAGE电泳分析

水飞蓟蛋白组分的SDS－PAGE电泳分析见图1。

从图1中可以看出，水飞蓟各蛋白组分的分子质量分布广泛，条带较多。清蛋白约有14条谱带，主要条带比较集中的分布在32.4～44.5 ku和14.5～24.8 ku 2个区域；球蛋白大约有16条谱带，高分子质量条带比清蛋白多，主要条带分布与清蛋白相近，这是因为采用传统的Osbome分级分离的方法难免会造成清蛋白和球蛋白的相互污染，造成“你中有我，我中有你”的情况［8］；谷蛋白主要有9条谱带，而且条带较浅，这可能与其溶解性较低，不能很好的溶解并进入到凝胶中有关。醇溶蛋白由于溶解性较差，纯度较低，所以电泳未测出清晰的条带（图略）。

图1 水飞蓟蛋白组分的SDS－PAGE电泳图

2.2 水飞蓟蛋白组分的氨基酸组成分析

本试验样品的前处理采用酸水解法，因此氨基酸含量测定中色氨酸含量未进行检测，其他种类的氨基酸含量测定结果如表1所示。

表1 水飞蓟蛋白组分中氨基酸的组成和含量（g/100g蛋白）

由表1可见，水飞蓟各蛋白组分的氨基酸含量丰富，种类齐全，其中谷氨酸的含量最高，清蛋白中最高可达25.57%。谷氨酸不仅属于鲜味氨基酸，在医学上谷氨酸还用于治疗肝性昏迷，改善儿童智力发育；其次，精氨酸、天冬氨酸在各蛋白组分中含量都很高，对婴幼儿来说，精氨酸属于必需氨基酸，在调节免疫力、辅助治疗高氨血症、肝脏机能障碍等疾病方面颇有效果；此外，清蛋白和球蛋白中亮氨酸和缬氨酸的含量较高，均在5%以上，这两种氨基酸都属于必需氨基酸，是重要的营养补剂，在治疗肝脏疾病、抗菌、抗病毒等方面都有显著效果。各蛋白组分的必需氨基酸含量都远远高于FAO/WHO推荐模式中的成人氨基酸需求量，球蛋白的必需氨基酸含量基本符合儿童（赖氨酸含量略低）的FAO/WHO推荐模式，其他蛋白组分中赖氨酸和亮氨酸含量低于FAO/WHO推荐模式中儿童的氨基酸需求。

对各蛋白组分中的氨基酸按照它们的化学性质进行归类，计算不同种类氨基酸的分配比例如表2所示。

表2 水飞蓟蛋白组分中不同种类氨基酸的构成分布/%

清蛋白中酸性氨基酸质量分数最高（35%），其他蛋白中非极性氨基酸含量最高。横向比较氨基酸在各蛋白组分中的含量，其中非极性氨基酸在谷蛋白中所占比例最大（38.86%），极性中性氨基酸在球蛋白中所占比例最大（24.58%），酸性氨基酸在清蛋白中最高，碱性氨基酸在醇溶蛋白中最高（20.86%）。

2.3 水飞蓟蛋白组分的营养价值分析

蛋白质是人类赖以生存的营养素之一，蛋白质的含量和质量是决定其营养价值的关键因素。而蛋白质的质量主要取决于其氨基酸的组成及分配比例。本试验利用氨基酸组成计算水飞蓟各蛋白组分的营养参数，结果如表3所示。

表3 水飞蓟蛋白组分的营养评价

从表3数据可见，4种蛋白组分中，水飞蓟谷蛋白的E/T值最高（44.85%），其次是球蛋白，醇溶蛋白最低；在各蛋白组分中，球蛋白的氨基酸评分最高（83），其次是清蛋白，醇溶蛋白最低；含硫氨基酸是水飞蓟球蛋白和谷蛋白的第一限制性氨基酸，赖氨酸是水飞蓟清蛋白、球蛋白和谷蛋白的第二限制性氨基酸；预测蛋白质效率比（PER）常作为蛋白质营养高低的评价指标，PER越大其营养价值越高。通常认为蛋白的PER大于2.0时，表明该蛋白具有较高的营养价值［9］。从表3可以看出，谷蛋白的PER最高，其次为球蛋白和清蛋白，醇溶蛋白的PER最小。

蛋白质能否在体内被吸收也是考察其营养价值的重要指标。水飞蓟不同蛋白组分的体外消化试验结果表明，清蛋白具有最高的体外消化率（92.55%），其次为球蛋白，而醇溶蛋白的体外消化率最低，仅为54.52%。因此，蛋白质氨基酸评分即使很高，如果消化率很低，也不能被人体充分吸收，从而影响了该蛋白的营养价值。

为了综合评价各蛋白组分的营养价值，分别计算了各蛋白组分的蛋白质消化率校正的氨基酸分数即PDCAAS值。其中，清蛋白的 PDCAAS最高为0.73，其次为球蛋白，醇溶蛋白的PDCAAS最低，仅为0.29。这说明清蛋白的营养价值最高，而醇溶蛋白的营养价值最低。球蛋白尽管氨基酸评分最高，但蛋白消化率较低而影响了其PDCAAS值。在用PDCAAS评价蛋白质营养时，当PDCAAS高于1.0的蛋白质是能满足人体必需氨基酸需要量的高质量蛋白质，低于1.0的低质量蛋白质的氨基酸组分不能满足2～5岁儿童对氨基酸的需要量［11］。尽管清蛋白的PDCAAS较高，但仍然不能作为高质量蛋白单独使用。如果补充蛋白中限制性氨基酸含量或者与其他可以弥补其限制性氨基酸不足的蛋白混合使用，将会极大的提高其营养价值。

2.4 水飞蓟蛋白的功能特性

2.4.1 水飞蓟蛋白组分的溶解性

蛋白质的溶解性是其最基本的功能性质，因为它往往影响着蛋白质其它的功能性质，例如起泡性、乳化性、凝胶作用等。溶解性差的蛋白质在食品加工中的应用是非常有限的。影响蛋白质溶解性的因素有很多，例如pH、温度以及有机溶剂等。pH对各蛋白组分溶解性的影响如图2所示。由图2可见，水飞蓟各蛋白组分的溶解度随pH的升高呈现先降低后升高的趋势，清蛋白的溶解曲线变化最明显，在pH5附近的溶解度最低。在等电点附近，蛋白的溶解度最低，在高pH条件下（pH＞7.0），净的负电荷的增加有利于蛋白溶解度的迅速增加，而在低pH条件下（pH＜3.0），蛋白溶解度的增加取决于正电荷的增加，清蛋白、球蛋白和谷蛋白在碱性条件的蛋白溶解性明显高于酸性条件，而醇溶蛋白的溶解度在试验pH范围内都较低，最低点在pH 5附近。

图2 水飞蓟蛋白组分的溶解性

2.4.2 水飞蓟蛋白组分的其他功能特性

水飞蓟各蛋白组分的持水性、持油性、乳化性和起泡性等见表4。

表4 水飞蓟蛋白组分的功能特性

由表4可见，持水性和持油性最高的是谷蛋白，清蛋白的持水性最差，持油性最低的是醇溶蛋白，蛋白质的持水能力和持油能力源于蛋白质分子表面所含基团的性质，由于各蛋白所含的基团不同所以其所表现出来的性质也有所差异。

起泡性是蛋白质的一项重要功能性质，是蛋糕、面包、冰淇淋等食品加工过程中非常重要的质量控制指标，凡是影响蛋白质内在结构及其聚集状态的内、外在因素，都会影响其起泡性。清蛋白由于具有较好的溶解性，溶液中有效的蛋白浓度较大，因此吸附到气－液界面上的蛋白质分子较多，有利于界面性质的发挥，所以其起泡性最高，谷蛋白和醇溶蛋白由于溶解性较差，起泡性都较低，但清蛋白的泡沫稳定性较低，原因尚待研究。

蛋白质分子同时含有亲水性和亲油性基团，在油水混合液中可以扩散到油水界面形成油水乳化液，蛋白质促使油和水形成乳化液并保持乳化液稳定的能力即为蛋白质的乳化特性。蛋白质的乳化性与溶解性、表面疏水性以及表面电荷分布相关，溶解性和表面疏水性是决定蛋白乳化性的2个主要因素。可溶性蛋白能够扩散并吸附在油－水界面，这是决定它们乳化性好坏的关键因素，所以不溶性蛋白对乳化作用的贡献很小［16］。试验中清蛋白的乳化性和乳化稳定性最高，而醇溶蛋白因为其溶解性最低，所以它的乳化性和乳化稳定性在各蛋白组分中也是最低的。当然蛋白质的乳化能力不仅与其溶解性有关，还与蛋白质的分子结构有关，蛋白分子中亲水基和疏水基的比例对其乳化特性有较大影响，球蛋白虽然有较高的乳化性，但其乳化稳定性却较低。

3 结论

3.1 水飞蓟各蛋白组分主要以中、低分子量蛋白为主，电泳条带比较集中地分布在32.4～44.5 ku和14.5～24.8 ku两个区域。

3.2 水飞蓟各蛋白组分的氨基酸组成合理，种类齐全，富含赖氨酸；清蛋白中酸性氨基酸含量最高，其他蛋白中非极性氨基酸含量最高；氨基酸评分依次为球蛋白、清蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白；谷蛋白的蛋白质效率比（PER）最高，其次为球蛋白和清蛋白，醇溶蛋白的PER最小；清蛋白具有最高的体外消化率和PDCAAS，醇溶蛋白的体外消化率和PDCAAS最低。

3.3 4种蛋白组分中清蛋白的溶解性最好，醇溶蛋白最低；清蛋白的持水性最差，谷蛋白的持水性和持油性最高，醇溶蛋白的持油性最低；清蛋白具有最高的起泡性和较低的泡沫稳定性；清蛋白的乳化性和乳化稳定性在4种蛋白组分中最高，醇溶蛋白的乳化性和乳化稳定性在各蛋白组分中最低。

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