急性酒精中毒大鼠脑干部DTI与AQP4表达的相关性研究

刘慧敏，郑文斌，孔令梅，张海都，陈若伟，洪璧楷

（1.汕头大学医学院，广东 汕头，515041；2.汕头大学医学院第二附属医院放射科，广东 汕头515041）

急性酒精中毒临床常见。酒精及其氧化产物，如乙醛、乙酸盐具有很强的神经毒性作用，酒精中毒可以诱导脑组织出现细胞毒性水肿，早期星形胶质细胞细胞毒性水肿显著［1－2］。急性酒精中毒所致脑水肿类型及水肿程度在活体水平很难做到定量诊断，而DTI作为MRI的一项新技术，在诊断脑水肿方面具有独特的优势。水通道蛋白4（aquaporin 4，AQP4）是大脑组织重要的水通道蛋白，在维持大脑组织水平衡中起重要作用，其在各种病理损害所致的脑水肿形成过程中的作用机制越来越受到关注。脑干中央的髓鞘溶解即瓦勒变性是酒精中毒脑白质严重损害之一［3－4］。本研究利用DTI参数值观察大鼠脑干部在急性酒精中毒后的演变规律，探讨AQP4在脑水肿形成过程的作用机制及其与DTI的相关性，为临床诊断及治疗提供定量影像指标。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 健康雄性SD大鼠30只，体质量200～250 g，由汕头大学医学院实验动物中心提供。动物自由进食及饮水。动物房内12 h光暗交替。相对湿度55%，温度22℃。

1.1.2 主要仪器与试剂 使用 GE Signa HDx 1.5 T超导MR仪，3 in线圈，病理摄像彩色头（日本奥林巴斯公司）及AQP4（武汉博士德生物工程有限公司）。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 实验方案 大鼠随机分为正常对照组（n＝5）和急性酒精中毒组（n＝25），急性酒精灌酒后1、3、6、12、24 h行 MRI。随后断头取脑，选取脑干部分别行HE染色及AQP4免疫组化染色，比较对照组与实验组的DTI及病理结果。

1.2.2 实验模型 以往实验［5］研究表明，当以15 ml／kg体质量灌胃时可达到急性酒精中毒标准。本实验用酒为北京红星二锅头食用白酒（56%v／v），主要成分是乙醇、水，产地北京，按15 ml／kg体质量的剂量一次性灌胃。对照组大鼠以15 ml／kg体质量食用自来水灌胃。

1.2.3 MRI检查 大鼠腹腔注射10%水合氯醛（3 ml／kg体质量）麻醉，麻醉满意后，行 MRI扫描，充分保暖，放置MRI扫描床，俯卧位，头先进。扫描序列包括 T2WI、T1WI及DTI，扫描参数：T1WI：TR 263.3 ms，TE 23.4 ms，层厚3.0 mm，无间隔，翻转角90°；T2WI采用FSE：TR 4 420 ms，TE 108.3 ms，层厚3.0 mm，无间隔，翻转角90°；DTI单次激发自旋平面回波序列（SE－EPI）：TR 6 000 ms，TE 107.7 ms，层厚3.0 mm，无间隔，FOV 12 c m×12 cm，矩阵128×128，NEX 1，b值＝1 000 s／mm2，采集方向为25个。

1.2.4 DTI数据处理 MRI扫描完成后将原始数据送至 A W4.3工作站（GE mdeiacl syste m advantage window 4.3），使用Functool软件重建ADC图及部分各向异性（fractional anisotropy，FA）图，将大小为5 mm2的ROI置于原始图像脑干部进行测量。为减少测量时放置ROI受主观因素影响，请2位经验丰富的医师测量，取平均值。

1.2.5 病理学检查 取材后置于4%多聚甲醛溶液中固定24 h，组织块经脱水透明石蜡包埋成块，组织切片烤干后分别行HE、AQP4免疫组织化学染色。免疫组化染色图像分析应用Image－Pro Pl us 6.0显微图像分析系统测定免疫反应产物的累积光密度值（IOD值），每张切片取5个视野，所得数据经计算取每组均值。

1.3 统计学分析 用SPSS 13.0统计分析软件进行统计学分析，数值以±s表示。急性酒精中毒各组均数分别与对照组进行独立样本均数t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 MRI检查结果 对照组及实验组大鼠在常规T2WI及T1WI均未见明显异常信号。DTI扫描（图1，2，见封3），ADC值及FA值测量结果（见表1）：实验组1、3、6 h ADC值与对照组比较组间差异均有统计学意义（P＜0.01），12、24 h组间差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组各时间点FA值与对照组比较组间差异均无统计学意义（P＞0.05）。酒精中毒组ADC值与FA值24 h内变化趋势一致，先持续降低后逐步回升（图3，见封3）。

2.2 病理组织学检查结果 HE染色（图4，见封3）：对照组脑干部细胞形态正常，细胞间隙未见增宽及变窄，细胞染色均匀，中毒组星形胶质细胞数目减少、核固缩，突起减少或消失，神经纤维束疏松；AQP4免疫组化染色（图5，见封3），对照组平均光密度值为0.228±0.022，造模后急性酒精中毒组AQP4表达光密度值先持续降低后逐步回升（图3，见封3），3 h达最低点，1、3、6、12、24 h平均光密度值分别为0.218±0.038，0.201±0.035，0.209±0.027，0.225±0.032，0.229±0.028；与对照组比较，3、6 h的AQP4表达光密度值差异有统计学意义（P＜0.05），1、12、24 h差异无统计学意义（P＞0.05）。

表1 酒精中毒各组ADC、FA值（±s）

表1 酒精中毒各组ADC、FA值（±s）

注：FA：部分各项异性；＊P＜0.01

参数值 对照组 急性酒精中毒组1 h 3 h 6 h 12 h 24 h ADC值（×10－3 mm2／s）FA值0.880±0.014 0.341±0.062 0.845±0.052＊0.339±0.023 0.800±0.056＊0.314±0.021 0.837±0.033＊0.319±0.054 0.873±0.062 0.331±0.031 0.879±0.057 0.335±0.023

3 讨论

脑水肿主要分2种类型，细胞毒性水肿和血管源性水肿。细胞毒性水肿指在血脑屏障完整的条件下，水分子主要积聚在细胞内，常继发于各种缺血、缺氧性脑损害；血管源性水肿指血脑屏障受损，毛细血管通透性增加，液体主要积聚在细胞外周，多见于脑挫裂伤、脑肿瘤压迫和炎症性疾病［6］。急性酒精中毒引起的脑水肿类型主要是细胞毒性水肿［1－2］；酒精在代谢过程中产生大量的氧自由基，易直接对脑组织产生氧化损伤［7］；酒精干扰谷氨酸盐受体、阿片类物质、GABA（γ－氨基丁酸）受体及5－羟色胺等多种物质在细胞内外的分布，造成细胞内外渗透梯度改变［8－11］。酒精代谢产物乙醛及乙酸盐具有较高的神经毒性作用，血液中高浓度乙醛可以直接渗透血脑屏障，干扰递质传递，直接附着于蛋白、酶、核酸及其他一些生物因子并干扰它们的功能。乙酸盐堆积抑制葡萄糖代谢，造成ATP生成减少，Na＋／K＋泵功能受限，Na＋在细胞内堆积，引起细胞肿胀，另外葡萄糖代谢受抑制，局部血流量减少，诱发脑组织缺血缺氧性损害［12－13］。细胞内外离子分布失衡、缺血缺氧性损害以及渗透梯度变化均可诱发细胞毒性水肿。

DTI作为MRI的新技术，不仅对评价锥体束病变及检测弥漫性轴索损伤（DAI）具有一定敏感性［14－15］，而且可以检测水分子弥散的FA、弥散速率及弥散方向的改变，定量分析ADC值及FA值的变化。ADC值变化不仅反映细胞内外水自稳状态，而且可以反映细胞外间隙及细胞体积变化，水分子在细胞内弥散运动受到细胞膜及细胞器的限制。当细胞外水分移至细胞内时，水分子弥散速率较正常组织减小，ADC值较正常组织减低。水分子弥散速率较正常组织增加，ADC值增高是出现血管源性水肿的标志［2，16］。FA值代表弥散各向异性，其值正常范围是0～1，0代表弥散方向最大同向性，1代表弥散方向最大异向性。研究［17］证实，组织内液体径向弥散速率降低时，FA值出现降低趋势。李雪莱等［2］研究重症急性酒精中毒大鼠1 h内脑组织变化情况发现，重度酒精中毒组大鼠脑组织在DWI上出现异常高信号，ADC值降低。本实验中，酒精中毒后24 h内研究结果表明，ADC值和FA值变化趋势表现为先下降后逐步回升，灌酒3 h内大鼠脑干部ADC值出现持续下降，原因在于急性酒精中毒早期以细胞毒性脑水肿为主，酒精及其代谢产物渗透细胞膜，引起细胞内代谢发生紊乱，酶和膜系统发生功能障碍，钠钾泵失调及大量钙离子内流，使细胞外水进入细胞内，细胞内水分子弥散受到细胞膜及细胞器的限制，所以ADC值降低，这与李雪莱等［2］研究结果基本一致。本实验结果表明3 h后ADC值是逐步回升的，提示细胞毒性水肿程度的减轻。FA值出现的变化趋势与ADC值一致，是先降低后回升，但各时间点FA值与对照组比较，组间差异均无统计学意义，我们认为，急性酒精中毒对脑干组织微结构和环境改变有一定的影响，但对反映水分子扩散各向异性程度的FA值变化不明显，间接反映了急性酒精中毒脑干部组织完整性破坏并不严重，提示水肿状态恢复正常是组织结构完整的基础。

AQP4作为中枢神经系统最主要的水通道蛋白，主要在血－脑和脑脊液－脑交界面上的星形胶质细胞上表达，对维持脑内水平衡起着非常重要的作用。由于研究侧重点、方法及部位的不同，AQP4在脑水肿形成及发展过程中的变化仍存在争议。Amir y－Moghadda m等［18］研究发现，胶质细胞足突部AQP4能够调节水分子的双向运输，当细胞内水分子积聚增多时，AQP4表达下调以减少水分子内流，细胞间隙内水分子积聚增多即血管间隙内水分子积聚增多时，AQP4表达上调转运细胞外水分子至细胞内。研究证实［19－21］，在脑组织缺血缺氧早期AQP4表达是降低的，这反映了机体内在的防御机制，即AQP4在早期的表达降低减少了细胞外水分子的跨膜转运，抑制了胶质细胞细胞毒性水肿的加重。Ke等［22］对大鼠重症脑外伤模型AQP4在脑水肿发展过程中表达多样性的研究发现，脑外伤血脑屏障遭到破坏时，即血管源性水肿时，AQP4表达下调以防止在渗透梯度及静水压的作用下水分子由血液进入脑组织，阻止脑水肿进一步恶化，在细胞毒性水肿存在时预测AQP4通道能够和K＋ 通道协同作用减轻细胞肿胀程度。汤崇辉［23］在急性酒精中毒对大鼠颅脑创伤后脑水肿研究中发现，急性酒精中毒能够加重脑水肿程度，AQP4的表达有利于脑水肿消退。实验组大鼠脑干部AQP4表达趋势表现为先下降后逐步回升，3 h下调到达最低点，到24 h AQP4表达上调超过正常对照组。细胞外水分进入细胞内时，脑组织出现细胞毒性水肿，由于机体的自我保护机制，AQP4下调以减少依赖AQP4通道的水分子从细胞外向胞内转移，以抑制细胞毒性水肿的加重，3 h后AQP4表达上调，由于AQP4双侧双向转运机制和AQP4表达的实效性及阶段性特点，AQP4不仅是水进入脑组织的通路，也是水排出脑组织的主要通路，可易化脑内多余水分的清除［24］。

研究表明［25］，正常脑组织中AQP4表达可以调节ADC值，在中风及外伤等急性神经性疾病中，影像学改变部分归因于组织AQP4表达水平的改变。本实验中，酒精中毒后3 h内细胞水肿程度逐渐加重，ADC值逐步降低，在同时间段里，AQP4表达下调，这反映了机体为阻止水分子进一步向细胞内转运、减轻细胞内水肿而出现相应的保护性机制。酒精中毒3 h后AQP4表达及ADC值不再继续下降，而同期出现逐渐回升，这反映了细胞内水肿程度的逐步减轻、细胞内微环境逐渐改善。DTI检查反映了急性酒精中毒早期所出现的细胞毒性水肿，ADC值变化可以为临床对急性酒精中毒的治疗提供参考价值。

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