四逆散对应激性肝郁小鼠的保护作用机制研究

郭青文 ，何 银 ，何蓉蓉

(1．江西省遂川人民医院，江西 吉安 343900;2．暨南大学，广东 广州 510632)

四逆散是出自《伤寒论》的经典名方，由柴胡、枳实、白芍、甘草按1∶1∶1∶1组成的散剂，近代医家用作汤剂，以水煎服。四逆散是疏肝解郁、调和肝脾的组方，主治阳郁厥逆、肝脾气郁等[1]。临床研究表明，四逆散对肝炎、纤维化和肝硬化有较好的预防和治疗效果[2-3]。现代药理学研究表明，四逆散不仅有保肝作用[4]，并有较好的抗抑郁作用[5]。但关于四逆散抗抑郁与保肝作用之间的联系并不清楚，其疏肝解郁的作用机制也不明确。本研究中利用小鼠拘束应激负荷模型评价了四逆散汤剂的疏肝解郁作用，并通过检测应激性激素水平以及肝脏炎症、氧化水平的变化探讨其可能的作用机制，为四逆散的临床使用提供实验依据。

1 材料与方法

1．1 实验材料

试药:四逆散是由康美药业股份有限公司提供的柴胡、枳实、白芍、炙甘草各250 g，加10倍量水浸泡20 min、煮沸60 min、提取3次合并滤液浓缩而成(提取率为15．62%)。丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，均购自南京建成生物工程研究所;甲醇为色谱纯，江苏汉邦科技有限公司产品;6-hydroxy-2，5，7，8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid(Trolox，为维生素E的水溶性衍生物)、2，2'-azobis(2-amidinopropane)dihydrochloride(AAPH)、荧光素钠(sodium fluorescein)均为日本和光纯药株式会社产品(Wako Pure Chemical Industries， Ltd，Osaka， Japan)。

实验动物:SPF级7～9周龄昆明种小鼠，雄性，体重18～22 g，购自广东省医学实验动物中心，动物实验许可证号SCXK(粤)2008-0002。实验动物在清洁级层流架中饲养，环境温度(23±2)℃，照明时间每日12 h(7:00-19:00)。饲养1周后进行试验。

1．2 试验方法

拘束应激负荷小鼠模型建立:将昆明小鼠随机分为空白对照组(C组)、应激模型组(M)组、应激模型＋维生素C对照组(P组)、应激模型＋四逆散高剂量组(SH组，1 000 mg/kg)、应激模型＋中剂量组(SL组，565 mg/kg)共5组，每组10只。小鼠连续灌胃给药1周，试验第6天时给予小鼠一次性拘束应激18 h(14:00～8:00)。期间所有小鼠禁食禁水。拘束18 h后，小鼠乙醚麻醉，心脏采血后置肝素处理的离心管中，5 000 r/min离心5 min，分离血浆储存在-20℃备用。取小鼠肝脏以生理盐水制成10%匀浆，12 000 r/min离心15 min后取上清液，用于测定生化指标。

血浆ALT和AST测定:ALT和AST水平根据试剂盒说明书测定[6]。

小鼠血浆皮质酮(CORT)测定:将小鼠全血置肝素处理的离心管中，5 000 r/min离心5 min，分离血浆，加入适量内标物皮质醇，用1．5 mL乙酸乙酯萃取，1 500 r/min离心5 min，收取上层乙酸乙酯液，下层再加1 mL乙酸乙酯萃取2遍，合并3次乙酸乙酯萃取液，用0．1 mol/L氢氧化钠溶液2 mL洗涤，再用1 mL蒸馏水洗涤2次，用氮气吹干乙酸乙酯液，加80 μL流动相溶解样品提取物。按Wood等[7]的方法，采用高效液相色谱(HPLC)内标法(内标物为皮质醇)测定血浆中CORT水平。HPLC检测条件为Hitachi高效液相色谱系统(包括L-6200型输液泵、L-5020型柱温箱、L-4000型紫外检测器、N2000色谱数据工作站)，检测波长为 254 nm，色谱柱为 5C18柱(150 mm ×4．6 mm，5 μm)，流动相为38%乙腈-水，流速1 mL/min。

小鼠肝组织抗氧化能力指标(ORAC)、MDA、一氧化氮(NO)测定:小鼠肝组织ORAC参考文献[8]方法测定。小鼠肝组织的氧化损伤产物MDA水平采用南京建成试剂盒测定。小鼠肝组织的炎症水平NO采用Griess法测定[9]。

小鼠肝组织SOD及GSH-Px活性测定:取10%的小鼠肝组织0．9%氯化钠注射液匀浆液，在4℃，12 000 r/min离心15 min，取上清液，稀释成1%肝组织匀浆，根据试剂盒说明书测定肝组织蛋白水平、SOD及GSH-Px活性。

小鼠肝组织皮质酮激素受体(GR)mRNA表达测定:取肝脏组织，用Trizol提取总RNA，逆转录反应以总RNA 3 μg为模板，总反应体系20 μL，42℃水浴1 h合成cDNA。PCR反应条件设置，94℃预变性 5 min，94℃变性 30 s，60℃退火40 s，72℃延伸 50 s，72℃再延伸7 min。重复b，c，d 3步30个循环，同法以18S mRNA为内参进行PCR扩增。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳，Bio-rad凝胶成像系统记录结果，Quantity One软件进行灰度分析。结果以GR与内参照物18S mRNA扩增片段灰度值的比值(relative intensity)表示GR mRNA相对水平。PCR反应结束后，进行琼脂糖凝胶电泳，用Bio-Rad凝胶成像系统记录结果，并以Quantity One软件进行灰度分析。

1．3 统计学处理

采用 SPSS 13．0软件，利用 ANOVA检验和 Dunnett's检验进行统计学处理，实验数据以(X ±s)表示，P ＜0．05有统计学意义。

2 结果

2．1 对小鼠血浆ALT和AST水平的影响

结果见图1。ALT和AST是反映肝脏炎症程度的重要指标。拘束应激负荷后，小鼠血浆ALT水平显著上升，表明应激诱发肝炎。与模型组(M组)相比，阳性药、四逆散高中剂量均能显著降低应激负荷小鼠血浆ALT和AST水平(P＜0．05)。

图1 四逆散对拘束应激负荷小鼠血浆ALT和AST水平的影响

2．2 对小鼠血浆CORT水平及肝脏GR表达的影响

结果见图2和图3。CORT是糖皮质激素的一种，与受体GR结合后调节应激反应。拘束应激负荷后，小鼠血浆CORT水平显著升高;与M组相比，阳性药及四逆散高中剂量均能显著降低应激负荷小鼠血浆CORT水平(P＜0．05)。GR mRNA表达的强弱可间接反映机体皮质激素的响应水平。拘束应激负荷后，小鼠GR mRNA表达显著下调;与M组相比，阳性药及四逆散高中剂量对应激负荷小鼠的GR mRNA表达并无显著影响(P＞0．05)。

图2 四逆散对拘束应激负荷小鼠血浆CORT水平的影响

图3 四逆散对拘束应激负荷小鼠GR mRNA表达的影响

2．3 对小鼠肝组织抗氧化能力指数的影响

结果见图4和图5。拘束应激负荷后，小鼠肝组织ORAC值显著降低;与M组相比，阳性药及四逆高中剂量均能显著升高应激负荷小鼠肝组织ORAC值(P＜0．05)。

图4 肝组织ORAC指数测定示意图

图5 四逆散对拘束应激负荷小鼠肝组织ORAC的影响

2．4 对小鼠肝组织MDA水平的影响

结果见图6。MDA是衡量机体内脂质过氧化程度的一个重要指标，间接反映了细胞的损伤程度。拘束应激负荷后，小鼠肝组织MDA水平显著上升，表明应激对小鼠肝组织造成损伤。与M组相比，阳性药及四逆散高中剂量均能显著降低应激负荷小鼠肝组织MDA 水平(P ＜0．05)。

2．5 对小鼠肝组织NO水平的影响

结果见图7。NO大量生成被认为是细胞损伤一个重要原因，阻止其释放是作为阻止炎症损伤重要方法之一。拘束应激负荷后，小鼠肝组织NO水平显著升高，表明拘束应激诱发了肝损伤。与M组对比，阳性药及四逆散高中剂量均能显著降低应激负荷小鼠肝组织NO水平(P＜0．05)。

图6 四逆散对拘束应激负荷小鼠肝组织MDA水平的影响

图7 四逆散对拘束应激负荷小鼠肝组织NO水平的影响

2．6 对小鼠肝组织SOD与GSH-Px活性的影响

图8 四逆散对拘束应激负荷小鼠肝组织SOD活性的影响

图9 四逆散对拘束应激负荷小鼠肝组织GSH-Px活性的影响

3 讨论

拘束应激使动物产生的综合应激反应接近人的心理应激，该模型与中医七情学说在认识上存在着共同点，可以用应激模型来模仿人类情志致病[10]。本研究结果表明，小鼠拘束负荷18 h后血浆ALT和AST活性显著上升，表明拘束应激负荷造成肝脏损伤。与模型组相比，四逆散高中剂量均能显著降低应激负荷小鼠血浆ALT和AST水平，表明四逆散对应激负荷造成的肝损伤有保护作用。在应激下，机体为了防止炎症反应过激，在启动全身炎症反应的同时也启动内部的抗炎效应，其中重要的表现之一就是释放大量的皮质激素以激活GR发挥抗炎功能[11]。本研究发现，与空白对照组对比，拘束应激负荷小鼠血浆CORT水平显著上升，而GR mRNA表达下调。提示在拘束应激负荷下，CORT与GR结合减少，甚至可能出现CORT抵抗，其抗炎作用得不到正常的发挥。四逆散给药后，拘束应激负荷小鼠血浆CORT水平明显下降，而GR mRNA表达并没有显著性变化，这表明四逆散能降低血浆游离CORT水平，但不具有激活GR表达的药效。四逆散可能主要是通过降低血浆CORT水平，使激素抵抗效应减轻或消除而发挥对拘束应激负荷小鼠的保肝作用。

此外，CORT与GR结合，能激活细胞内PKA、P38丝裂素活化蛋白激酶途径信息调控路径，提高iNOS的表达量，从而造成细膜及线粒体DNA(mtDNA)等生理功能[14]，会造成内源性活性氧(ROS)的大量产生。本研究结果也表明，拘束应激负荷能造成小鼠肝脏NO水平大量上升。本研究进一步以生物膜中不饱和脂肪酸脂质过氧化反应的最终产物MDA水平来反映机体过氧化状态，以ORAC值反映机体清除氧自由基的能力，进而评价机体的氧化与抗氧化平衡。结果发现，与空白对照组相比，拘束应激负荷小鼠肝组织MDA水平显著升高，而ORAC值明显降低，说明拘束应激负荷对小鼠肝组织细胞膜造成损伤，使小鼠机体肝细胞处于一种氧化损伤状态。与模型组相比，四逆散能显著改善因拘束应激引起的MDA和ORAC变化，缓和机体的过氧化状态。进一步的研究结果显示，拘束应激负荷显著降低小鼠肝组织的SOD和GSH-Px活性，表明拘束应激负荷对肝组织的抗氧化系统有破坏作用，导致小鼠清除自由基的能力下降。四逆散给药后，拘束应激负荷小鼠SOD及GSH-Px活性明显升高，表明四逆散能增强应激状态下小鼠的抗氧化能力，恢复小鼠机体的氧化与抗氧化平衡。

总之，四逆散的疏肝解郁作用可能与缓解应激负荷引起的肝损伤有关，其保护机制与抑制应激负荷引起的炎症发生以及氧化损伤作用有关。

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