高效液相色谱法测定大鼠血浆中咪达唑仑含量＊

刘宏达，张志清，任静华，何文娟

(1．河北省沧州市人民医院，河北 沧州 061000;2．河北医科大学第二医院，河北 石家庄 050000)

咪达唑仑又称速眠安，属苯二氮 类镇静催眠药。咪达唑仑为亲脂性物质，能直接抑制脑干网状结构上行激活系统，具有强大的镇静催眠作用，临床广泛用于抑郁症、焦虑等疾病。其在pH＜4的酸性溶液中形成稳定的水溶性盐，临床制剂为盐酸盐或马来酸盐。咪达唑仑主要在肝脏经肝微粒体酶CYP3A4氧化，因此经常将此药作为探针药物[1-2]研究其药代动力学变化。目前已报道的咪达唑仑血药浓度测定方法，流动相制备复杂，血浆样品处理操作烦琐、成本高。本研究中建立了检测大鼠血浆中咪达唑仑质量浓度的高效液相色谱法，方法简便、准确、灵敏度高，可为咪达唑仑大鼠体内的药动学研究提供方法学参考。

1 仪器、试药与动物

高效液相色谱系统，包括515泵、486紫外检测器、Empower Application操作平台(美国Waters公司);GL-20G-Ⅱ型冷冻离心机(上海安亭科学仪器厂);XW-80A型涡旋混合器(上海医科大学仪器厂)。咪达唑仑对照品(宜昌人福药业责任有限公司，批号为MD111106，含量100．8%);咪达唑仑注射液(江苏恩华药业集团有限公司，批号20110825，规格为5 mL∶5 mg);乙腈(色谱纯，天津市康科德科技有限公司，批号为111203)。健康SD大鼠，清洁级，雄性，体重(300±10)g，由山西省动物实验中心提供，动物许可证号为SCXK(晋)2009-0001。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱:Diamonsil C18柱(250 mm ×4．6 mm，5 μm);流动相:乙腈 -水(62 ∶38，V/V);流速:1．0 mL/min;检测波长:225 nm;柱温:30 ℃;进样量:20 μL。

2．2 血浆样品处理

冷冻血浆样品室温自然解冻，10 000 r/min离心5 min，取上层 200 μL 于离心管中，加内标(150 μg/mL 地西泮溶液)20 μL，混匀后，加提取剂500 μL(异丙醇 ∶乙酸乙酯=2∶8)，涡旋震荡1 min，10 000 r离心处理 5 min，取上清液 500 μL，于 37 ℃水浴，氮气流吹干，100 μL甲醇复溶，进样。

2．3 专属性试验

取咪达唑仑对照品溶液直接进样，另取空白血浆、空白血浆加咪达唑仑对照品及给药后2 h的血浆样品，分别按2．2项下方法处理并测定，记录色谱图。结果表明，在该色谱条件下，咪达唑仑和内标物峰形良好，保留时间分别为6．7 min和8．2 min，大鼠血浆中内源性物质对咪达唑仑的测定无干扰。见图1。

图1 高效液相色谱图

2．4 标准曲线绘制

取空白血浆，制备质量浓度分别为 0．1，0．25，1，5，10，20，30 μg/mL的咪达唑仑模拟血浆样品，按2．2项下方法处理并测定。以咪达唑仑与内标的峰面积比值(Y)为纵坐标，血浆药物质量浓度(X)为横坐标进行线性回归，得回归方程为 Y=0．075 2 X-0．004 2，r=0．999 9(n=7)。结果表明，咪达唑仑质量浓度在0．1～30 mg/L范围内与峰面积呈良好线性关系。

2．5 回收率试验

咪达唑仑及内标提取回收率:取空白血浆15份，分为3组，分别制备0．25，5，20 mg/L的咪达唑仑模拟血浆样品，按照2．2血浆样品处理、测定，记录峰面积。咪达唑仑峰面积与等量咪达唑仑对照品溶液直接进样的峰面积比值，即咪达唑仑的提取回收率在85% ～91%之间，符合要求，RSD值也均在规定范围内，结果见表1。

表1 大鼠体内血浆中咪达唑仑提取回收率和方法回收率试验结果

方法回收率:取空白血浆15份，分为3组，分别制备0．25，5，20 mg/L的咪达唑仑模拟血浆样品，按照2．2血浆样品处理、测定，记录峰面积。按照标准曲线方程计算测得浓度与加入的理论浓度的比值即方法回收率。结果表明，低、中、高3种质量浓度的方法回收率分别为(109．8±4．54)% ，(101．6±3．28)% 和(104．9 ±4．23)%，符合要求，结果见表 1。

2．6 精密度试验

取空白血浆15份，分为3组，每组5份，分别制备0．25，5，20 mg/L的咪达唑仑模拟血浆样品，按照2．2血浆样品处理方法处理，分别于1日内不同时间处理并测定，计算日内精密度;于0，1，2，3，4 d处理并测定，计算日间精密度。3种质量浓度模拟血浆样品的日内精密度和日间精密度的 RSD值均符合要求，该方法精密度良好，结果见表2。

表2 日内和日间精密度(n=5)

3 讨论

在药学的一般试验中，常规选择200～250 g的健康大鼠，而本研究因为咪达唑仑药物用量小，仅10 mg/kg给药量，对大鼠尾静脉注射的准确性要求高，故选用了300 g左右的健康成年大鼠，目的是为减少操作失误，保障注射剂量的准确性。

近年来临床上在镇静、抗惊厥的治疗中常选择咪达唑仑持续静脉滴注，此途径可使咪达唑仑浓度维持在一个稳定的范围，但长时间静脉滴注可使其血浆半衰期显著延长。在使用高剂量咪达唑仑作诱导麻醉时，药效学方面存在较大的个体差异[3-4]。因此，研究血浆中咪达唑仑浓度测定方法具有十分重要的意义。关于血浆咪达唑仑浓度测定已有文献报道[5-7]，本试验从临床药物检测角度建立了高效液相色谱法测定咪达唑仑在大鼠体内的分布浓度，通过对大鼠体内不同剂量给药和检测给药后不同时间药物的分布情况，取得了大量科学数据，为该药的研究建立了简便、准确的科学分析方法。

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