血清对大鼠角膜感觉神经损伤修复的影响

唐丽颖 张谋鑫 郑明城 颜玉缘 陈 炜 谢茂松

血清对大鼠角膜感觉神经损伤修复的影响

唐丽颖1张谋鑫1郑明城1颜玉缘1陈 炜1谢茂松2

1.福建医科大学临床医学眼视光学系 2.福建医科大学附属第一医院眼科

目的：探讨血清对大鼠角膜感觉神经损伤修复的影响。方法：SD大鼠40只随机分为两组：实验组和对照组，每组各20只。选取大鼠右眼制作大鼠角膜神经损伤模型，实验组和对照组于损伤后分别用大鼠血清和生理盐水点眼，每日3次。分别于造模后2d、4d、7d、9d、11d、14d、28d采用自制角膜知觉测定计测量麻醉后大鼠双眼的角膜知觉，分别于造模后7d、14d、28d采用ELISA法检测大鼠角膜乙酰胆碱含量。结果：对照组2天、4天、7天的作用力均明显高于实验组，说明血清有促进角膜神经损伤修复的作用，但组间差异只有第7天的具有统计学意义（=-2.459，=0.028）。实验组大鼠角膜知觉差不多在受伤后7天就基本恢复，对照组差不多在9～14天才恢复。对照组7天、14天的角膜乙酰胆碱含量低于实验组，但组间差异只有第7天的具有统计学意义（=2.684，=0.028）。结论：血清可促进大鼠角膜感觉神经损伤修复。

大鼠 血清 角膜感觉神经损伤 乙酰胆碱

角膜含有丰富的感觉神经纤维，当有异物接触角膜时，眼睑便会不由自主地合上以保护眼睛。若角膜神经损伤，就会大大减少角膜对外物接触的敏感性，使角膜容易受损，引起角膜炎、角膜混浊、角膜溃疡、角膜穿孔甚至丧失眼球等严重后果。角膜神经损伤在临床上十分多见，但目前临床上尚无可促进角膜神经损伤后再生药物，本实验通过制作大鼠角膜神经损伤模型来探讨血清治疗大鼠角膜神经损伤的疗效。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组

健康雄性8周龄SD大鼠40只，体重约250±20g，购自福建医科大学实验动物科学部，按随机数字表随机分为对照组（20只）和实验组（20只）。

1.2 方法

1.2.1大鼠角膜神经损伤动物模型建立

大鼠用速眠新（吉林省华牧动物保健品有限公司）麻醉，在显微镜下用直径为3mm的带芯角膜环钻在角膜中心钻取一直径为3mm、深度为0.5mm的环行切口，注意避免损伤其下的后弹力层和内皮层，即制成大鼠角膜神经损伤动物模型。采用角膜荧光素染色显示损伤的区域，眼前节分析系统照相并分析损伤区域的大小。

1.2.2大鼠角膜神经损伤后的治疗

大鼠角膜神经损伤实验组采用大鼠血清滴眼（大鼠血清制备：大鼠股动脉抽血1mL，静置30min后释出血清，1000转/分离心10min，取上清血清用于滴眼），每日3次；对照组用生理盐水滴眼，每日3次。

1.2.3角膜知觉测定

造模后2d、4d、7d、9d、11d、14d、28d采用自制的尼龙丝角膜知觉测定计测量大鼠麻醉后的角膜知觉。将角膜知觉测定计的尼龙丝从150mm开始轻轻触及受检眼的角膜中央。角膜知觉正常者，尼龙丝弯曲并可立即出现反射性瞬目或有感知。若不发生瞬目反射或无感知，为角膜知觉消失。如瞬目反射迟钝或感知不敏感，将尼龙丝从150mm依次逐量（间隔10mm）减少直至10mm，通过标准曲线计算出尼龙丝的作用力，以作用力的大小来反映大鼠角膜知觉敏感度，记录结果。角膜知觉测定计标准曲线测定：尼龙丝从150mm依次逐量（间隔10mm）减少直至10mm，将尼龙丝轻触分析天平，测出不同长度尼龙丝弯曲所需的力，以长度为横坐标，作用力为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.4大鼠角膜乙酰胆碱含量检测

采用ER-1419大鼠乙酰胆碱Elisa试剂盒（上海江莱生物科技有限公司）检测大鼠角膜乙酰胆碱含量，取大鼠角膜中央直径为3mm角膜片（原角膜神经损伤区），加入稀释液150μL，匀浆，转速为1000转/min，时间为10分钟。高速离心后取50μL加入待测样品孔，37℃反应120分钟。每孔加检测溶液A工作液50μL，37℃反应60分钟后，再每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）50μL，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1～2分钟，150μL/每孔，甩干，依序每孔加底物溶液90μL和终止溶液50μL，而后立即用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。

1.2.5统计学方法

2 结果

2.1 大鼠角膜知觉敏感度

对照组2天、4天、7天的作用力均明显高于实验组，但组间差异只有第7天的统计学意义，结果见表1。实验组角膜知觉差不多在受伤后7天就基本恢复，而对照组角膜知觉差不多在9～14天才恢复。

表1 大鼠角膜知觉测定（N）

2.2 大鼠角膜乙酰胆碱含量

对照组7天、14天的角膜乙酰胆碱含量低于实验组，但组间差异只有第7天的具有统计学意义，结果见表2。

表2 大鼠角膜角膜乙酰胆碱含量（g/mol）

3 讨论

角膜知觉检查方法不断改进,Boberg-Ans[1]将尼龙线至于一个套管内，其游离端的长度和曲度均可改变，垂直眼在角膜表面，直至引起反应为止，经校正后即可了解作用的力。本实验模拟以上的测量方法，分别采用1～15cm（14.523g～0.0268g）的尼龙丝测量实验组和对照组大鼠的角膜知觉，测量结果为：对照组2天、4天、7天的作用力均明显高于实验组，但组间差异只有第7天的统计学意义。由第七天数据得知测量引起角膜知觉的平均力量为6.8mg。考虑为大鼠血清中的神经生长因子可促进角膜神经损伤修复，进而引起角膜知觉的提高。

角膜无色透明，无血管、淋巴管，有丰富的神经纤维支配。其中大多数是副交感神经的胆碱能神经支配[6]。本实验通过Elisa检测对照组和实验组大鼠经过7天、14天、28天后角膜中乙酰胆碱的含量而推测角膜神经修复的程度，7天测量结果的差异具有统计学意义。考虑实验组的神经损伤修复速度明显大于对照组，即实验组的角膜匀浆中乙酰胆碱的浓度较大。通过该方法研究角膜知觉损伤修复效果的文献不多。

知觉是角膜重要的功能之一，具有保护眼前部的作用。角膜营养依赖于完整的感觉神经支配，角膜的神经支配非常丰富，感觉十分敏锐，损伤可致神经营养性角膜病，引起持续性角膜上皮损伤[2]。血清的生物力学和生物化学特性与正常泪液相同，其可向眼表提供上皮修复所需的基本营养物质血清中含有丰富的细胞生长因子，如表皮生长因子( EGF)、转移生长因子( TGF) 、成纤维细胞生长因子( FGF) 、神经生长因子( NGF) 等，纤维连接蛋白( FN)，维生素A 和E 这些营养物质可以促进眼表上皮的再生和修复，防止角膜溃疡穿孔的发生[3]。其中，神经生长因子（NGF）是一种强的促细胞分裂因子，能促进神经细胞及多种非神经元性细胞的增生和分化。自体血清还含有大量氨基酸、核酸关联物质, 可以改善组织营养, 刺激细胞再生, 加速组织修复[4]。这些表明自体血清可以成为一种很好的泪液替代物, 向眼表修复提供必要的营养物质。

关于角膜知觉研究，Cocher和Bonnet[5]对Boberg-Ans法进行了改进，证实角膜中央阈值平均为10mg，周边为18mg。本实验与之相比数据偏低，可能因素有尼龙丝的材质、麻醉的深度、偶可对角膜上皮产生损伤等。

综上所述，自体血清具有来源取材方便、制作简单、经济、并发症少等特点, 滴眼治疗促进角膜神经损伤的修复和缩短疗程。因此, 自体血清是一种理想的治疗方法。

[1] Boberg-Ans J. Experience in clinic al examination of corneal sensitivity: comeal sensitivity and the naso-lacrimal reflex after retrobulbar anaesthesia[J]. Br J Ophthalmol, 1955, 39（12）: 705-726.

[2] Okada Y, Reinach PS, Kitano A, et al. Neurotrophic keratopathy: its pathophysiology and treatment[J]. Histol Histopathol, 2010,25（6）: 771-780.

[3] 周媛，邹新蓉.自体血清治疗持续性角膜上皮缺损的临床分析[J]. 眼外伤职业眼病杂志, 2010,32（12）：888-890.

[4] 曲忻,郝继龙.自体血清联合糖皮质激素局部应用治疗非感染性角膜溃疡[J]. 中国实用眼科杂志, 2006, 2 ( 3) : 341-342.

[5] 季迅达，朱浩浩，李洪，2型糖尿病角膜知觉减退及其与眼表异常的相关性研究[J]. 眼视光学杂志, 2007，9(2): 97-99.

[6] 郝旖旎，毕燕龙.角膜感觉神经及其损伤的研究发展[J]. Int Rev Ophthalmol, 2011,35(5):307-311.