莲房原花青素对极低频电磁场致星形胶质细胞氧化损伤的预防作用

张 瑞，段玉清，武 妍，张海晖，施岚晨，杨 玲，陆荣柱

(1.江苏大学食品与生物工程学院，江苏镇江212013;2.江苏大学基础医学与医学技术学院预防医学教研室，江苏镇江212013)

极低频电磁场(extremelylowfrequency electromagnetic fields，ELF-EMF)是频谱在 0～300Hz的电磁波发出的以非热效应为主的非电离辐射［1］，主要由电力供应设备、电脑、手机及各种家用电器产生，是与我们日常生活和工作最为密切的电磁场之一。众多流行病和动物实验研究表明，长期暴露在ELF-EMF下，可造成中枢神经系统、免疫系统和生殖系统等功能障碍。其中脑部中枢神经系统需氧量大、不饱和脂肪酸含量高以及抗氧化防御系统薄弱等特点致使其对ELF-EMF最为敏感，最易受ROS攻击产生氧化应激损伤［2］。ELF-EMF诱发脑氧化应激导致抗氧化酶活力降低和脂质过氧化的研究报道较多［2-6］，但目前仍集中在健康风险的评估，缺少评估后防护措施的研究报道。ELF-EMF对人类健康尤其是脑部功能将构成极大的威胁，为了提高国民整体健康水平，必须采取多渠道的措施预防ELFEMF对健康的不利影响。其中在日常饮食中添加活性物质来强化饮食，作为预防ELF-EMF所致的疾病是一种行之有效的方法，但目前仅有Ilhan等报道银杏叶提取物能调节大鼠脑内抗氧化酶活性，预防ELF-EMF对脑的氧化应激损伤［4］。Amara等［5］和 Ghodbane［6］等分别报道补充锌和硒能改善ELF-EMF对脑内抗氧化酶活性的影响。莲房原花青素(procyanidins from lotus seedpod，LSPC)是课题组从睡莲科植物莲的成熟花托中分离的主要活性成分之一，是由儿茶素或表儿茶素以 C4-C8或C4-C6键连接而成的2～4聚体所组成。现已证实LSPC在体内外均具有很强的清除自由基和抗氧化活性［7］，并对损伤极强的电离辐射有显著的防护作用，而且抗氧化应激是其防护机制之一［8］。而原花青素作为公认的强抗氧化剂和自由基清除剂，目前却未涉及对ELF-EMF的研究报道。星形胶质细胞是中枢神经系统中最多的细胞，能参与神经元突触形成及调节［9］，促进神经干细胞和神经前体细胞的分化［10］，所以星形胶质细胞是否正常生长直接关系着脑功能。故本实验以星形胶质细胞为模型，探讨LSPC对ELF-EMF致星形胶质细胞氧化应激损伤的预防作用。为其预防机制的深入研究提供参考，最终为其在食品和保健品行业的开发利用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

实验动物 出生24h以内SD乳鼠(动物生产许可证号:SCXK-(苏)2009-0002)由江苏大学实验动物中心提供;莲房原花青素 本实验室自制，纯度＞95%;高糖DMEM培养粉、新生牛血清 GIBCO公司;胰蛋白酶 Sigma公司;二甲基亚砜(DMSO)、四甲基偶氮唑蓝(MTT)、SOD试剂盒、MDA试剂盒、ROS试剂盒、Ca2+试剂盒 南京建成生物工程研究所。

Multiskan Spectrum型全波长酶标仪 美国热电公司;Spectra Max Gemini荧光酶标仪 美国Molecular Device公司;德国Leica TCS SP5Ⅱ型激光共聚焦显微镜 德国莱卡显微系统有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 星形胶质细胞的原代培养及鉴定 出生24h内的SD乳鼠，70%医用酒精消毒后，无菌条件下断头分离大脑皮层，去掉脑膜、小脑和血管，胰酶消化之后，1000r/min离心5min。去上清，加入培养液(DMEM培养液+20%小牛血清)，用吹管吹打均匀。调整密度为1×106个/mL，将细胞悬液接种至预先铺有多聚赖氨酸的6孔培养板中，置于37℃、5%的CO2、饱和湿度的CO2培养箱中培养，24h后换液，以后每2～3d换液一次。细胞培养至12～14d，可用于实验。用星形胶质细胞的标志蛋白(GFAP)进行免疫细胞化学鉴定，95%以上为阳性细胞［11］。

1.2.2 辐射装置 实验采用极低频电磁场发生器，场强可通过调节电压控制。该仪器由两圆形Helmholt线圈和调压器构成，线圈外径为13cm，内径为9cm，匝数为400。样品细胞培养板置于两圆形线圈之间。两线圈通以同方向50Hz的交流电，中心区域可产生交变电磁场。

1.2.3 细胞损伤模型的建立 将处于对数生长期的星形胶质细胞分为正常组和辐射组，其中正常组不做任何处理，辐射组分别在不同磁场强度(2、4、6、8、10mT)下辐射不同时间(60、90、120min)，建立 ELFEMF致星形胶质细胞损伤的模型，选出ELF-EMF的最佳辐射场强和时间。

1.2.4 细胞生存率测定 采用MTT法检测细胞生存率。将星形胶质细胞以1×105个/mL密度接种至预先包被赖氨酸的96孔板中，待细胞处于对数生长期，分为正常组和辐射组。细胞按1.2.3方法分组辐射后，37℃孵育24h，吸出培养液，PBS洗2遍，加入MTT(5g/L)40μL，继续培养4h后，吸去上清，每孔加入150μL二甲基亚砜(DMSO)，充分振荡10min，用全波长酶标仪在570nm波长下测定各孔吸光度。每组设6个复孔。按式(1)计算细胞生存率:

1.2.5 LSPC对ELF-EMF致星形胶质细胞损伤的预防实验 将96孔板中培养至第12d的星形胶质细胞随机分为正常对照组、辐射对照组和LSPC预防组，其中正常对照组不做任何处理，辐射对照组和LSPC组均在场强8mT下连续辐射90min，LSPC预防组预先分别加入终浓度为5、10、20μg/mL的 LSPC共同培养8h后辐射，辐射后将细胞置于CO2培养箱中继续培养24h后，MTT法检测细胞生存率。

1.2.6 细胞内SOD和MDA含量测定 将星形胶质细胞以1×105个/mL密度接种至预先包被赖氨酸的24孔板中，待细胞处于对数生长期，分为正常对照组、辐射对照组和LSPC预防组。同1.2.5法处理细胞，培养结束后吸去培养液，加入细胞裂解液，置于冰上裂解 30min。刮下细胞，收集于 EP管中，12000r/min冷冻离心。吸取上清液，分别采用试剂盒的方法检测SOD和MDA含量。

1.2.7 细胞内ROS含量和分布 将24孔板中培养至第12d的星形胶质细胞随机分为正常对照组、辐射对照组和LSPC预防组。同1.2.5法处理细胞，培养结束后吸去培养液，加入无血清培养基稀释的DCFH-DA溶液，终浓度为10μmol/L，37℃下负载探针30min，PBS洗涤2次，采用荧光酶标仪检测细胞内ROS含量，每组测定104个细胞的荧光强度。激光共聚焦显微镜下拍照，激发光波长488nm，发射光波长525nm。

1.2.8 细胞内Ca2+含量测定 将24孔板中培养至第12d的星形胶质细胞随机分为正常对照组、辐射对照组和LSPC预防组。同1.2.5法处理细胞，培养结束后吸去培养液，加入5μmol/L Fluo-3AM染液，37℃孵育40min，PBS洗2次，激光扫描共聚焦显微镜测量。选用氩离子激光器，激发波长488nm，通过LaserSharp软件采集图像，运用图像分析软件LaserPix进行定量分析，每组测定50个细胞的相对荧光强度值，以相对荧光强度值代表细胞内游离Ca2+浓度。

2 结果与分析

2.1 ELF－EMF致星形胶质细胞损伤模型

表1为不同辐射场强和时间下星形胶质细胞的生存率。由表1可见，同一场强条件下，随着ELFEMF辐射时间增加，星形胶质细胞的生存率呈下降趋势。相同时间条件下，星形胶质细胞生存率随辐射强度增加呈下降趋势。当辐射时间为90min，磁场强度增大到8、10mT时，细胞生存率分别为53.22%和52.57%，与对照组相比均存在极显著性差异(p＜0.01)。因此，选取8mT下辐射90min为ELF-EMF致星形胶质细胞辐射损伤条件。

表1 不同辐射场强和时间对星形胶质细胞生存率影响(±s，n=6)Table 1 Effect of different field strength and time on astrocytes survival rates(±s，n=6)

表1 不同辐射场强和时间对星形胶质细胞生存率影响(±s，n=6)Table 1 Effect of different field strength and time on astrocytes survival rates(±s，n=6)

注:与正常对照组相比，*p＜0.05，＊＊p＜0.01。

场强(mT)细胞生存率(%)60min 90min 120min正常对照组100.00±1.49 100.00±2.67 100.00±2.41 2 90.28±2.21 84.53±3.13* 74.87±4.30*4 86.73±1.32* 77.47±2.45* 65.11±1.47＊＊6 82.04±3.30* 65.10±2.39＊＊ 52.10±3.25＊＊8 73.09±2.43＊＊ 53.22±1.23＊＊ 47.21 ±1.32＊＊10 69.86±2.16＊＊ 52.57±1.14＊＊ 49.18±4.26＊＊

2.2 LSPC对ELF－EMF致星形胶质细胞损伤的预防作用

表2为LSPC预处理后星形胶质细胞的生存率。由表2可见，在实验浓度范围内，LSPC对正常星形胶质细胞生长无明显影响(p＞0.05)。而经ELF-EMF辐射后，细胞生存率显著下降(p＜0.01)，经过不同浓度LSPC预处理后星形胶质细胞的生存率呈上升趋势，与辐射组相比具有显著性差异(p＜0.05)。提示在实验浓度范围内LSPC对ELF-EMF致星形胶质细胞损伤具有一定的预防作用。

2.3 细胞内ROS含量和分布

本身没有荧光的DCFH-DA可穿过细胞膜进入细胞，被细胞内酯酶水解转化生成DCFH，被ROS氧化生成绿色荧光物质DCF，其荧光强度和细胞内ROS水平成正比。由表3和图1可见，正常细胞中ROS含量处于相对较低的水平(图1A)，而 ELFEMF辐射后，细胞内ROS含量与正常对照组相比极显著升高(p＜0.01)(图1B)，说明经ELF-EMF辐射后细胞内产生了过多的ROS。而经LSPC预处理后再辐射的细胞内ROS含量均有所下降(图1C～E)，其中20μg/mL LSPC处理组ROS下降最多，与模型组相比存在极显著性差异(p＜0.01)。说明LSPC能预防并减少ELF-EMF所产生的ROS。

表2 LSPC对ELF-EMF致星形胶质细胞损伤的预防作用(±s，n=6)Table 2 Effect of LSPC on the viability of ELF-EMF-injured astrocytes(±s，n=6)

表2 LSPC对ELF-EMF致星形胶质细胞损伤的预防作用(±s，n=6)Table 2 Effect of LSPC on the viability of ELF-EMF-injured astrocytes(±s，n=6)

注:a:表示模型组存活率，与正常对照组相比，*p＜0.05，＊＊p＜0.01;与模型组相比，Δp＜0.05，ΔΔp＜0.01;表3 同。

LSPC浓度(μg/mL)正常组存活率(%)LSPC预防组存活率(%)0 100.00±1.43 54.38±2.75＊＊a 100.20 ±3.91 65.09 ±1.27＊＊Δ 10 101.89 ±2.41 75.34 ±2.01＊＊ΔΔ 20 100.17±1.22 90.78±1.39*ΔΔ 5

图1 星形胶质细胞内ROS的分布(×200)Fig.1 ROS assessment of astrocytes by DCFH-DA labeling(×200)

2.4 星形胶质细胞内SOD活力和MDA含量

经LSPC预处理前后的星形胶质细胞内SOD活力和MDA含量变化如表3所示。与正常对照组相比，模型组细胞内SOD活力极显著降低(p＜0.01)，MDA含量极显著升高(p＜0.01)，SOD活力下降一方面可能因为ELF-EMF辐照后细胞内产生过多的ROS，SOD为清除ROS而消耗;另一方面可能是经ELF-EMF辐照后直接导致细胞内的SOD含量下降所致。MDA含量增高说明过多的ROS使细胞发生脂质过氧化。而经LSPC预防组SOD活力随其浓度的增加而逐渐增强，MDA的含量随之下降，其中20μg/mL LSPC预处理组效果最显著(p＜0.01)。说明经LSPC预处理后，能预防ELF-EMF对SOD的破坏，同时降低细胞内MDA的产生。

2.5 星形胶质细胞内Ca2+含量

Fluo-3AM荧光探针能穿透细胞膜进入细胞，与钙离子结合形成Fluo-3-Ca2+复合物，该复合物具有绿色荧光，其相对荧光强度呈Ca2+依赖性，可以用相对荧光强度值代表胞内Ca2+含量。由表3可见，与对照组相比，模型组细胞内Ca2+含量极显著升高(p＜0.01)。LSPC预处理组能显著抑制细胞内Ca2+升高而且存在剂量-效应关系。结合之前实验结果可知，ELF-EMF可导致星形胶质细胞氧化应激，生成过量的自由基，后者可引起生物膜功能的改变，造成离子通道受损，细胞外钙离子大量内流，使其嘌呤氧化酶含量增多，导致更多自由基生成，进一步加重氧化损伤［12］。

表3 LSPC对细胞内SOD活力、MDA含量、ROS和Ca2+荧光强度的影响(±s，n=6)Table 3 Changes of the concentration of SOD and MDA，the fluorescence intensity of ROS and Ca2+of astrocytes in each group(±s，n=6)

表3 LSPC对细胞内SOD活力、MDA含量、ROS和Ca2+荧光强度的影响(±s，n=6)Table 3 Changes of the concentration of SOD and MDA，the fluorescence intensity of ROS and Ca2+of astrocytes in each group(±s，n=6)

.37模型对照组 11.75±0.58＊＊ 2.95±1.28＊＊ 307.19±16.28＊＊ 159.52±17.34＊＊模型 +5μg/mL LSPC 组 12.44±1.74＊＊ 2.67±0.74＊＊Δ 246.07±21.74＊＊ΔΔ 127.69±12.09＊＊ΔΔ模型 +10μg/mL LSPC 组 13.83±0.95＊＊Δ 1.26 ±0.55＊＊ΔΔ 215.20 ±20.55＊＊ΔΔ 110.66 ±13.54＊＊ΔΔ模型+20μg/mL LSPC组 17.27±1.83ΔΔ 0.99±0.35*ΔΔ 166.05±13.50*ΔΔ 92.05±15.27*ΔΔ荧光强度正常对照组 18.45±1.35 0.83±0.21 149.33±10.15 83.47±10组别 SOD活力(U/mgprot)MDA含量(U/mgprot)DCF荧光强度(104cells)Fluo-3-Ca2+

3 讨论

已有文献研究表明，原花青素对辐射损伤具有一定的保护作用［13-14］，但采用原代培养的大鼠星形胶质细胞为模型，考察LSPC对ELF-EMF损伤的预防作用尚未见报道。

氧化应激及自由基的堆积在诱发神经变性疾病方面起着重要作用。正常生理条件下，细胞内源生成的ROS除具有生理活性外，多余的ROS可被细胞内的抗氧化物质和抗氧化物酶及时清除，以维持细胞内氧化还原平衡状态。当机体受到ELF-EMF辐照后，细胞内生成过多的ROS，这种平衡即被打破，导致细胞产生氧化应激损伤。SOD是机体细胞抵御氧化损伤最重要的酶类之一，主要清除体内有氧代谢所产生的超氧阴离子自由基，使机体免受损害［15］。MDA是脂质过氧化产物，可反映机体脂质过氧化程度［16］。本实验发现，电磁辐射可引起细胞SOD活力下降，ROS和MDA含量升高，而加入LSPC预处理后，SOD活力、ROS和MDA含量均较模型组明显改善。提示LSPC具有预防ELF-EMF致星形胶质细胞氧化应激损伤的活性。

Ca2+是参与细胞各种生理活动的重要离子之一，在细胞调节中的功能是多方面的。近年的研究提出了许多关于细胞内Ca2+浓度升高引起细胞损伤甚至死亡的机制，主要认为Ca2+上升能导致细胞能量代谢障碍，触发一系列酶促反应，促进氧自由基生成［17］、激活非选择性氧离子通道等途径产生细胞毒性作用，最终影响细胞的功能。实验结果显示，电磁辐射导致细胞内Ca2+超载，进一步刺激ROS产生，造成对细胞的氧化损伤，而加入LSPC预处理后可有效抑制Ca2+含量上升，从而预防细胞损伤。

4 结论

氧化应激可能是ELF-EMF对细胞损伤作用的机制之一。LSPC对ELF-EMF造成星形胶质细胞氧化损伤具有明显的预防作用，其作用可能与LSPC清除自由基和抗氧化活性有关。

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