比格犬卵巢子宫内雌激素受体ERα、ERβ的免疫组织化学定位

许琴，李建瑛，任秀梅，赵彦斌，胡仲明，许永华，孙兆增，刘一，刘文森

(1.军事医学科学院军事兽医研究所，长春 130122;2.兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科，乌鲁木齐 830000;3.吉林大学农学部，长春 130000;4.军事医学科学院实验动物中心，北京 100071)

比格犬原产于英国，是一种小型猎犬，现为国际通用的标准实验犬。犬排卵发生在第一次减数分裂开始时，排卵后不久生发泡发生破例，卵子在输卵管内经1～3d发育至成熟，而大多数哺乳动物排出的卵母细胞已经成熟［1］，因此犬的辅助生殖研究进展缓慢，仍有许多技术问题未得到解决。雌激素通过其受体在靶器官内发挥生殖调控及生理病理功能，雌激素受体(estrogen receptors，ER)是核受体超家族成员，雌激素受体有两个亚型:即ERα和ERβ，人的ERα于1986年由法国学者 Chambon首次克隆出［2］，1996年 Mosselman和Kuiper分别从人和大鼠组织中克隆出了第二种雌激素受体亚型并将其命名为 ERβ［3，4］。ERα 与 ERβ 在人、大鼠、小鼠研究的比较多，尤其在雌激素依赖性生殖系统疾病方面的研究已经相当深入，在牛、羊、猪、犬、鸡、鱼类上也有研究，但大多集中于两种雌激素受体基因的mRNA表达方面［5－8］。研究表明 ERα 和 ERβ 的氨基酸序列和基因序列有很高的同源性，但 ERα/ERβ组织学分布不同，参与了不同器官的生理和病理作用。本文在前期对比格犬发情期与间情期卵巢与子宫正常组织形态比较研究的基础上，对两种雌激素受体在这两种组织中的表达做进一步分析，以期为两种受体在比格犬生殖内分泌调控中的作用做初步的探索。

1 材料与方法

1.1 实验动物

经产比格母犬6只，20～22 kg，其中经血清学、行为学、外观体征确定为发情期的两只，处于间情期的4只，由军事医学科学院实验动物中心提供【SCXK－(军)2007－001】，无菌手术在军事医学科学院实验动物中心实验室内进行【SYXK－(军)2007－005】，并按照实验动物使用的3R原则给予人道关怀。

1.2 仪器设备及试剂

莱卡切片机(德国)，Olympus显微镜(日本)，BI2000图像分析系统(成都泰盟)，37℃恒温箱(北京六一仪器厂)，组化孵育湿盒(福州迈新)。

莱卡包埋石蜡，即用型免疫组织化学超敏UltraSensitiveTMSP 试剂盒 (产品编号:KIT－9707)，DouSPTM免疫组化双染试剂盒(产品编号:KIT－9999)，DAB 显色剂(产品编号:DAB－0031)，0.01 mol/L柠檬酸抗原修复液(pH 6.0)，0.01 mol/L TBS(pH 7.2－7.4)，均购自福州迈新生物技术开发有限公司。兔抗人 ERα(H－184)多克隆抗体(sc－7207，Santa Cruz，美国);兔抗大鼠 ERβ 多克隆抗体 (ab3577，Abcam，英国)。

1.3 方法

1.3.1 标本处理

实验动物比格犬按照发情期与间情期分组，经盐酸氯胺酮10～20 mg/(kg·bw)肌内注射麻醉，无菌条件下取卵巢、子宫组织，记录并标明标签，4%多聚甲醛固定24～48 h，酒精梯度脱水，二甲苯透明，浸蜡，包埋，莱卡切片机切取 4 μm厚度组织，防脱片捞片，60℃烘烤过夜。

1.3.2 ERα、ERβ免疫组化染色

(1)UltraSensitiveTMSP免疫组化试剂盒 ERα、ERβ的单染:按照说明书进行，一抗 ERα以 1∶100稀释后使用，ERβ以1∶900稀释后使用，DAB显色。

(2)DouSPTM免疫组化双染试剂盒 ERα、ERβ的双染:按照说明书进行操作，按照预实验结果，一抗的上样顺序为先上 ERα，后上 ERβ，ERα用 BCIP/NBT显色，ERβ，用 AEC显色，水性封片剂封片。

(3)DouSPTM免疫组化双染试剂盒ERα单染:按照ERα、ERβ双染步骤进行，其中ERβ用抗体稀释液取代。

(4)DouSPTM免疫组化双染试剂盒ERβ单染:按照ERα、ERβ双染步骤进行，其中ERα用抗体稀释液取代。

以上操作中，阴性对照一抗均用抗体稀释液取代。每种组织及不同的蛋白因子均至少做3个重复。

2 结果

2.1 ERα、ERβ在比格犬卵巢内的表达

ERα、ERβ在比格犬卵巢内的表达(DAB显色)见图1。ERα主要表达于卵泡颗粒细胞(图1a)、卵巢间质腺腺上皮细胞(图1b)，定位于胞核，卵细胞核及卵细胞胞质内也有表达，ERα在卵泡膜内膜的间质细胞及小动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、小静脉内皮细胞内也有少量表达，同样定位于胞核内(图1c)。ERα表达于膜黄体细胞的胞核内(图1d)，而在黄体颗粒细胞却胞核与胞质内均有表达(图1e)。并且发情期与间情期两个不同生理状态时，ERα的表达量似存在差异。ERβ主要表达于卵泡颗粒细胞(图1f)，卵巢间质腺的腺上皮细胞(图1h)及颗粒黄体细胞(图1f)，少量表达于卵巢间质动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、静脉内皮细胞(图1i)，均定位于胞质。图1见彩插2。

2.2 ERα、ERβ在比格犬子宫内的表达

ERα、ERβ在比格犬子宫内的表达(DAB显色)见图2。ERα主要表达于子宫内膜腺体细胞胞核内(图2a)，而ERβ主要表达于子宫内膜腺体细胞胞质(图2b)，在血管内皮细胞及平滑肌细胞胞质内也有表达(图2c)。图2见彩插3。

2.3 ERα、ERβ在比格犬子宫内的共表达

ERα、ERβ在比格犬子宫内的共表达见图 3。BCIP/NBT碱性磷酸酶显色更清楚地表现出ERα主要表达于子宫内膜腺体腺上皮细胞胞核内，而在腺体周围的基质细胞胞核内也有表达(图3a)。AEC过氧化物酶显色与DAB显色出现同样的结果，ERβ主要表达于子宫内膜腺体腺上皮细胞胞质内，在腺体基质中的血管上皮细胞及平滑肌细胞的胞质内也有表达(图3b)。BCIP/NBT与AEC双染未见ERα、ERβ在子宫内有明显的共表达现象(图3c)。图3见彩插3。

注：a.间情期犬卵巢的ERα表达；b. 发情期犬卵巢间质腺体的ERα表达；c. 卵巢ERα表达的阴性对照；d. 间情期犬黄体的ERα表达；e. 发情期犬黄体的ERα表达；f. 发情期犬黄体的ERβ表达；g. 间情期犬卵巢的ERβ表达；h. 发情期犬卵巢的ERβ表达；i. 发情期犬卵巢间质内动脉的ERβ表达。图1 ERα、ERβ在比格犬卵巢内的表达（DAB显色）Note: a. ERα expression in a diestrous canine ovary; b. ERα expression in the interstitial glands of an estrous canine ovary; c. Negative ERα expression in a control ovary; d. ERα expression in the corpus luteum of a diestrous canine ovary; e. ERα expression in the corpus luteum of an estrous canine ovary; f. ERβ expression in the corpus luteum of an estrous canine ovary; g. ERβ expression in a diestrous canine ovary; h. ERβ expression in an estrous canine ovary; i. ERβ expression in the arteries of an estrous canine ovary.Fig.1 Expression of ERα and ERβ in the canine ovaries

·2·

注：a. 间情期犬子宫内膜的ERα表达；b. 发情期犬子宫内膜的ERβ表达；c. 子宫内膜间质动脉的ERβ表达。图2 ERα、ERβ在比格犬子宫内的表达（DAB显色）Note: a. ERα expression in the endometrium of a diestrous canine uterus; b. ERβ expression in the endometrium of an estrous canine uterus; c. ERβ expression in the interstitial artery of the endometrium of a canine uterus.Fig.2 Expression of ERα and ERβ in the canines uterus

注：a.间情期犬子宫内膜的ERα表达, BCIP/NBT染色；b. 间情期犬子宫内膜的ERβ表达 AEC染色；c. 发情期犬子宫内膜ERα、ERβ表达的双染。图3 ERα、ERβ在比格犬子宫内的共表达Note: a. ERα expression of the endometrium of a diestrous canine uterus. BCIP/NBT staining; b. ERβ expression of the endometrium of a diestrous canine uterus. AEC staining; c. ERβ expression of the endometrium of an estrous canine uterus. BCIP/NBT & AEC double staining.Fig.3 Co-immunoexpression of ERα and ERβ in the canines uterus

3 讨论

雌激素受体作为核受体超家族成员，以激素依赖的形式在生殖系统、骨骼、心血管系统、造血系统、中枢及外周神经系统发挥多种生理功能［［9，10］。为探讨雌激素受体在比格犬生殖调控中的作用机理，本研究就ERα、ERβ在子宫及卵巢中的表达进行了初步的研究，结果表明不论动物处于何种生殖生理阶段，ERα主要表达于卵泡颗粒细胞、卵巢间质腺腺上皮细胞的胞核内，在卵泡膜内膜的间质细胞及小动脉血管内皮细胞和平滑肌细胞、小静脉内皮细胞的胞核内也有少量表达，而ERβ则以相同的组织特异性表达于上述组织细胞的胞质内。ERα表达于膜黄体细胞的胞核内，而在黄体颗粒细胞却胞核与胞质内均有表达。而ERβ则仍特异表达于不同生理阶段黄体细胞的胞质内，但两种雌激素受体在黄体不同生理状态时的表达量似存在差异。在子宫内ERα主要表达于子宫内膜腺体腺上皮细胞胞核内，而在腺体周围的基质细胞胞核内也有表达。ERβ主要表达于子宫内膜腺体细胞胞质内，在腺体基质中的血管上皮细胞及平滑肌细胞的胞质内也有表达。BCIP/NBT与AEC双染未见 ERα、ERβ在子宫内有明显的共表达现象。而Louis LRP等在犬乳腺肿瘤中的研究结果表明:ERα特异性免疫染色仅发现于一例肉瘤癌的上皮细胞和少数肌源性上皮细胞胞核内;ERβ表达于上皮细胞和血管平滑肌细胞的胞核及胞质内［11］;Takahashi等［12］在缺血再灌注的猴海马ERβ的定位研究表明ERβ在CA1神经元细胞免疫定位于胞核和胞质;Pasterkamp［13］研究小组则认为:雌性大鼠视前核ER mRNA定位于胞质，而与配体结合或未结合的ER蛋白均定位于胞核。与上述研究结果比较，本研究中ERβ主要定位于胞质，而在胞核只见零星表达，分析其原因可能是:所研究组织的种属差异，组织所处的生理或病理状态的差异，ERβ处于配体结合状态与否，以及可能的ERβ的不同剪接异构体表达等。Cammarataa等［14］在ERβ的多种剪接异构体在不同处理的人晶状体上皮细胞的亚细胞定位的比较研究中表明 ERβ－1优势定位于线粒体，而 ERβ－2分布于所研究细胞的整个细胞质与核内，认为两种剪接异构体不同的亚细胞定位可能是雌激素信号系统的一种新的调控和功能。

研究中发现处于不同生理状态下的黄体 期ERα、ERβ的表达有其特殊性，ERα在间情期仅表达于黄体细胞的胞核，而发情期时则胞核胞质内均有表达;ERβ则表达于不同黄体期的黄体细胞胞质内，但表达量在间情期与发情期似有所增加。黄体细胞分为两种即膜黄体细胞(假黄体细胞)和黄体颗粒细胞(真黄体细胞)，电镜下，两种黄体细胞具有分泌类固醇激素腺细胞的结构特点，即丰富的滑面内质网和管状嵴的线粒体，发达的高尔基复合体和含胆固醇的脂类小泡，无分泌颗粒。颗粒黄体细胞主要分泌孕激素和松驰素(妊娠黄体分泌)，膜黄体细胞与颗粒黄体细胞协同作用分泌雌激素［15，16］。黄体的分泌状态对比格犬的生殖状态的维持具有举足轻重的作用，因犬不同于其他哺乳动物生殖生理的一个特点，就是犬维持有较长的黄体期，甚至长于其妊娠期，因此调控犬黄体的激素分泌状态可能是犬生殖调控的一个重要切入点，因此有必要对不同生理状态下比格犬黄体 ERα、ERβ及孕激素受体(progesteron receptor，PR)的表达情况作进一步的研究。

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