磁共振成像对扩张型心肌病转基因模型小鼠左右心室对比分析

朱皓，吕丹，高凯，张连峰，2

(1.中国医学科学院，北京协和医学院，医学实验动物研究所，卫生部人类疾病比较医学重点实验室，北京 100021;2.国家中医药管理局人类疾病动物模型三级实验室，北京 100021)

扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)是导致心力衰竭的主要病因之一，是一种以单侧或双侧心腔扩大和心肌收缩功能受损为主要特征的心肌疾病［1－3］，临床表现为心室收缩功能减低、伴或不伴有充血性心力衰竭和心律失常，可发生栓塞和猝死等并发症。

近年来发展起来的高场强磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)影像学技术在评价心肌病变方面已经得到比较广泛应用。临床研究表明应用心脏电影(CINE)MRI可以看到扩张型心肌病患者的左心室容量明显增大，各室壁运动呈弥漫性减弱，而射血分数、短轴缩短率及室壁增厚率明显变小［3］。同时，随着临床 MRI技术的发展，心脏 MRI已成为无创性评价右心室结构及功能的理想方法［4，5］。

cTnTR141W小鼠是由本实验室建立的一种扩张型心肌病转基因模型小鼠［6］。在以往的研究中，利用超声分析研究活体 cTnTR141W转基因小鼠模型左心室结构和功能改变，发现该模型小鼠的左心室扩大，室壁变薄，心肌收缩力下降，成为扩张性心肌病研究的小鼠模型之一。但是，已有的研究主要集中在左心室的结构与功能方面。本文的目的是利用高场强MRI对活体扩心病转基因小鼠模型左、右心室进行对比研究，确定cTnTR141W转基因小鼠右心室的病理生理改变，确定该小鼠作为右心室心肌病的动物模型可行性。

1 材料和方法

1.1 实验动物

本实验采用2、4、6和8月龄雌性cTnTR141W扩心病转基因小鼠模型及同龄转基因阴性对照小鼠(non－transgenic mice，NTG)各 3只作为研究对象。模型前动物由北京维通利华股份有限公司提供【SCXK(京)2009－0007】。实验在中国医学科学院医学实验动物研究所卫生部人类疾病比较医学重点实验室进行【SYXK(京)2010－0029】。实验中涉及动物的操作程序已经得到中国医学科学院医学实验动物研究所实验动物使用与管理委员会的批准，批准号为 ILAS－GC－2012－001。

1.2 MRI图像扫描

扫描前采用1.5%～2%异氟烷和氧气混合气体对小鼠进行吸入麻醉(Visualsonics，Canada)。当小鼠完全麻醉后，将小鼠俯卧位固定于扫描床上的小鼠心脏阵列线圈上，并且使小鼠胸部对准线圈中心。利用生理参数监护系统(SA Instruments，Belgium)实时监控小鼠的呼吸和心电(ECG)，并且利用呼吸、ECG门控触发采集信号。同时利用热风使动物体温保持(37±1)℃。

利用Varian 7.0 T/160 mm磁共振仪(Varian，Palo Alto，CA，USA)，首先进行梯度回波序列(gradient echo，GRE)扫描小鼠胸腔标准横轴位，然后进行心脏电影扫描。心脏电影(CINE)扫描采用ECG和呼吸门控激发。①在标准的横轴位图像上，定位线通过左室心尖和二尖瓣中点，即可获得左室两腔心切面;②在左室两腔心切面上，定位像通过左室心尖和二尖瓣口中点，即可获得四腔心切面;③在左室两腔心或四腔心切面上，定位线从心底至心尖垂直于左室长轴均可获得一系列左室短轴切面图像。范围覆盖心底至心尖，于呼气末屏气进行扫描，获得7～8层心室短轴位电影图像。整个采集过程由心电和呼吸门控触发。CINE扫描参数:TE:2.3 ms，TR:157 ms，翻转角(flip angle):20°，层厚(thickness):1 mm，层间距(Gap):0 mm，视野(FOV):25 mm ×25 mm，激励次数(NEX):2，矩阵(matrix):256×256。每一心动周期采集12帧电影图像。由此得到各月龄转基因模型小鼠与对照组左心室(left ventricle，LV)和右心室(right ventricle，RV)短轴图像(图 1)。

1.3 参数测量及统计

采用MRI自带软件Vnmr J 3.1软件对心脏电影图像进行测量和计算。在心室短轴层面选择每一层面的舒张末和收缩末时相的图像各一帧(图1，彩插4)，用鼠标手工分别绘制出左、右心室内膜的轮廓曲线，乳头肌层面将乳头肌画入血池内，不包括左室流出道层面。用公式［7］

计算左、右心室舒张末期容积(end－diastolic volume，EDV)和收缩末期容积(end－systolic volume，ESV)，并计算射血分数(ejection fraction，EF)。每个指标重复测量3次，取3次测量的平均值。

数据采用SPSS 13.0统计软件进行分析，各个参数采用平均数±标准差表示，组间比较采用 t检验。用P＜0.05表示差异的显著性。

1.4 病理分析

选用6月龄对照组及 cTnTR141W转基因模型小鼠，颈椎脱臼法牺牲小鼠后，打开胸腔取出心脏，将心脏组织固定在中性福尔马林中24 h，脱水，石蜡包埋及切片，H＆E或 Masson染色后显微镜下观察(Nikon显微镜，日本)组织学变化。

2 结果

2.1 cTnTR141W转基因小鼠心室的磁共振图像分析

利用MRI心脏电影序列(CINE)对同窝阴性小鼠3只和cTnTR141W转基因小鼠3只进行动态分析，磁共振图像见图2。与同窝阴性小鼠相比，cT－nTR141W转基因小鼠在2月龄出现双侧心室腔扩张的趋势，8月龄时，双侧心室腔明显扩张，动态电影图像显示双侧室壁运动度明显降低。

2.2 cTnTR141W转基因小鼠的左心室功能分析

通过心脏 MRI图像，分别对2、4、6和8月龄的NTG和cTnTR141W转基因模型小鼠进行左心室形态及功能分析。结果如图3所示，2月龄时，cTnTR141W转基因模型小鼠左心室EDV和ESV均大于对照组，而EF值小于对照组，但无明显差异;但4、6和8月龄这三个时间点cTnTR141W模型小鼠左心室EDV和ESV均大于对照组，而EF值小于对照组，并且差异有显著性(P＜0.05)，这与我们实验室已经报到的超声心动图的分析结果是一致的［6］。

分别在 2、4、6和 8月龄四个时间点监测 cT－nTR141W转基因模型小鼠左心室形态和功能的变化情况。结果显示，与同窝阴性小鼠比较，4、6和8月龄cTnTR141W转基因模型小鼠左心室舒张末容积(LV EDV)分别增加了38.56%、56.67%和54.54%;收缩末容积(LV ESV)分别增加了102.5%、137.2%和 168.3%;射血分数(LV EF)降低了 34.22%、39.07和45.18%。

与2月龄同组小鼠比较，8月龄的 cTnTR141W转基因小鼠左心室舒张末容积(LV EDV)增加59.66%，收缩末容积(LV ESV)增加了约1倍，射血分数(LV EF)降低28.05%，而对照组小鼠无明显变化(如图3)。以上结果表明，随着年龄的增长，cT－nTR141W转基因小鼠左心室扩张和心室功能下降越来越显著。

注:用CINE序列计算不同月龄(2、4、6、8月龄)的转基因阴性对照小鼠(NTG)和cTnTR141W转基因模型小鼠的(A)左室舒张末容积(LV EDV);(B)左室收缩末容积(LV ESV);(C)左室射血分数(LV EF)。图3 小鼠左心室功能参数测定Note:Left ventricular functional parameters of the mice at 2，4，6 and 8 months of age:(A)Left ventricular end－diastolic volume;(B)Left ventricular end－systolic volume;(C)Left ventricular ejection fraction.Fig.3 Left ventricular functional parameters of the mice

2.3 cTnTR141W转基因小鼠的右心室功能分析

分别对2、4、6和 8月龄的 NTG和 cTnTR141W转基因模型小鼠心脏MRI电影(CINE)图像进行右心室形态及功能分析。结果如图4所示，在2月龄时，cTnTR141W转基因模型小鼠右心室的EF值已明显小于对照组(P＜0.05)，4、6和8月龄cTnTR141W转基因模型小鼠右心室 EDV和ESV均大于对照组，并且有显著性差异(P＜0.05)。这种差异一直持续到8月龄。

分别在 2、4、6和 8月龄四个时间点监测 cT－nTR141W转基因模型小鼠右心室形态和功能的变化情况。结果显示，与同窝阴性小鼠比较，4、6和8月龄cTnTR141W转基因小鼠右心室舒张末容积(RV EDV)分别增加了16.8%、18.14和48.14%;收缩末容积(RV ESV)分别增加了60.66%、87.64和157.3%;射血分数(RV EF)分别降低了27.67%、47.61%和64.59%。

与2月龄同组小鼠比较，8月龄的 cTnTR141W转基因模型小鼠右心室舒张末容积(RV EDV)增加70.52%，收缩期容积(RV ESV)增加了约1.5倍，射血分数(RV EF)降低57.22%，而对照组小鼠无明显变化(图4)。以上结果表明，随着年龄的增长，cTnTR141W转基因小鼠右心室扩张和心室功能下降越来越显著。

2.4 cTnTR141W转基因小鼠模型右心室病理分析

将6月龄NTG和cTnTR141W转基因模型小鼠心脏进行病理解剖，发现cTnTR141W转基因小鼠的心脏整体明显大于对照组。与对照组相比，H＆E染色发现cTnTR141W转基因小鼠左、右心室明显增大(图5AB)，高倍镜下可见cTnTR141W转基因小鼠心肌细胞不均匀肥大，且排列不齐，心肌纤维局部出现断裂(图5C－D);Masson染色可见，cTnTR141W转基因小鼠心肌胶原沉积明显增多，纤维化程度明显增强(图5EF)。图5见彩插4。

注:用CINE序列计算不同月龄(2、4、6、8月龄)的转基因阴性对照小鼠(NTG)和cTnTR141W转基因模型小鼠的(A)右心室舒张末容积(RV EDV);(B)右心室收缩末容积(RV ESV);(C)右心室射血分数(RV EF)。图4 小鼠右心室心功能参数测定Note:Right ventricular functional parameters of the mice at 2，4，6 and 8 months of age:(A)Right ventricular enddiastolic volume;(B)Right ventricular end－systolic volume;(C)Right ventricular ejection fraction.Fig.4 Right ventricular functional parameters of the mice

注：对6月龄转基因阴性对照小鼠和cTnTR141W转基因模型小鼠进行组织学观察：（A）转基因阴性对照小鼠心脏短轴整体切片，H&E染色；（B）cTnTR141W转基因模型小鼠心脏短轴整体切片，H&E染色；（C）转基因阴性对照小鼠右室心肌，H&E染色高倍截图；（D）cTnTR141W转基因模型小鼠右室心肌，H&E染色高倍截图；（E）转基因阴性对照小鼠右室心肌，Masson染色；（F）cTnTR141W转基因模型小鼠右室心肌，Masson染色。图5 小鼠右心室组织学改变Note: Histology analysis of NTG and the cTnTR141W transgenic model mice at 6 months of age. The section of cardiac short axis from a NTG mouse, HE staining (A) and a cTnTR141W transgenic model mouse (B). Sections of the right ventricular myocardium from a NTG mouse (C) and a cTnTR141W transgenic model mouse (D), HE staining. Sections of the right ventricular myocardium from a NTG mouse (E), and a cTnTR141W transgenic model mouse (F). Masson staining.Fig.5 Pathological changes in the myocardium of right ventricle in the mice

3 讨论

在临床研究中，扩张型心肌病的超声心动图主要诊断依据是心腔大、室壁薄、瓣口小、运动弱。由于右心室结构的复杂性及胸腔所处位置的影响，使得常规的超声技术评估右心室功能相对困难。我们以往对心肌组织特异表达cTnTR141W基因的转基因小鼠心脏结构与功能的分析主要利用超声技术作为手段［5］，主要集中于左心室的研究。发现该模型小鼠的左心室扩大，室壁变薄，心肌收缩力下降。但对于右心室结构和功能尚未进行研究。

临床诊断证明MRI检测DCM左心室的心功能变化与超声心动图结果有良好的一致性，而且受右心室形态不规则的影响较小，准确性高，可重复性强［4，5，9］。磁共振(MRI)心脏电影序列(CINE)可获得整个心动周期内心脏运动的连续影像，可更清楚地显示出心肌于舒张期和收缩期不同时相的动态变化情况。心室短轴位电影图像，空间分辨率高，心内膜边界清晰，可以准确划分血池和心肌的界限，通过软件后处理得到心室整体功能的定量参数，如心室容量、射血分数等，能全面地反映心脏功能的情况，是临床评价心功能的可靠方法。正是由于以上优点，心脏cine－MRI己成为评估心脏结构和形态学的“金标准”。

本文的目的是利用高场强MRI对活体扩心病转基因小鼠模型左、右心室进行对比研究。通过2、4、6和8月龄转基因阴性对照小鼠和cTnTR141W转基因模型小鼠的 MRI心脏电影图像分析得出，在 cT－nTR141W转基因模型小鼠左心室与右心室的结构和功能变化的病理进程几乎同步，并且随着月龄增大，心室扩张、心室功能下降的情况越来越显著。对6月龄cTnTR141W转基因小鼠右心室进行病理组织学分析，发现右心室心肌细胞不均匀肥大、心肌间质纤维化程度显著增强。

除右室性心肌病外，多种原因会导致右心室功能下降，如肺动脉高压可使右心室负荷增大，心室扩张，冠状动脉血液灌注减少，心内膜下心肌和乳头肌缺氧、缺血状态加重，导致心肌细胞损害，出现右心室收缩功能减低，甚至出现慢性肺源性心脏病(简称肺心病)等疾病［10，11］。反过来，右心室功能下降也会影响肺循环，导致机体缺氧、缺血状态和多种继发性疾病［12］。本文利用 MRI心脏电影序列(CINE)，建立了小鼠右心室分析方法，并证实该小鼠具有明显和典型的右心室扩张表型，不仅可作为扩张性心肌病模型，同时也可作为右室性心肌病等右心室功能下降相关疾病研究的疾病动物模型。

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