下调HOXB7基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及机制探讨

赵宇清黄妍高蜀君丰有吉

1.复旦大学附属妇产科医院妇科，上海 200011；

2.复旦大学附属肿瘤医院妇瘤科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

3.上海市第一人民医院妇产科，上海 200080

下调HOXB7基因对卵巢癌SKOV3细胞增殖的影响及机制探讨

赵宇清1黄妍2高蜀君1丰有吉3

1.复旦大学附属妇产科医院妇科，上海 200011；

2.复旦大学附属肿瘤医院妇瘤科，复旦大学上海医学院肿瘤学系，上海 200032；

3.上海市第一人民医院妇产科，上海 200080

背景与目的：HOXB7基因在卵巢癌中过表达，可能与细胞恶性转化相关。本研究采用RNA干扰技术下调HOXB7基因表达，并探讨其对卵巢浆液性囊腺癌SKOV3细胞增殖的影响及可能的机制。方法：将SKOV3细胞分为3组：空白组(未作转染处理)、阴性对照组(转染阴性质粒pRNAT-neg)和HOXB7siRNA干扰组(转染干扰质粒pRNAT-hoxb7)。荧光显微镜观察转染效率，RT-PCR、蛋白质印迹法(Western blot)检测干扰效应。BrdU实验检测细胞增殖；流式细胞仪测定细胞周期、凋亡的变化；Western blot方法检测与细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E的表达变化。结果：转染干扰质粒pRNAT-hoxb7到SKOV3细胞后，HOXB7基因的表达受到高效且特异的抑制(P＜0.01)；细胞增殖量减少；G1期阻滞，Cyclin D1、Cyclin E表达下降；细胞凋亡率增加。结论：HOXB7基因的表达下调可抑制SKOV3细胞增殖，其机制可能与转录下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1、Cyclin E，使细胞周期阻滞在G1期有关；同时可促进其凋亡。

卵巢肿瘤；同源盒基因；增殖；细胞周期；Cyclin D1；Cyclin E

HOXB7基因属同源异型盒基因HOX家族HOXB簇。目前认为，其作为一类特殊的转录调节因子，不仅控制胚胎细胞的发育和分化，其过表达可能导致某些肿瘤的发生［1］，在白血病、黑色素瘤、乳腺癌、胰腺癌、肺癌、肠癌等肿瘤中均证实有HOXB7基因的高表达，并且与肿瘤细胞增殖、分化、侵袭、血管生成有关［2-12］。也有研究结果表明：HOXB7基因在卵巢浆液性囊腺癌，内膜样癌中表达较正常卵巢组织高，且与卵巢癌的分级有关［13］，但其在卵巢癌发生、发展中的作用尚不明了。本研究应用RNAi技术，将HOXB7基因的特异性小分子干扰RNA(siRNA)的重组质粒转染入卵巢浆液性囊腺癌SKOV3细胞，以观察阻断HOXB7基因表达对细胞增殖、细胞周期及凋亡的影响；同时检测细胞周期蛋白Cyclin D1、Cyclin E变化，初步了解其在卵巢癌中的分子机制。

1 材料和方法

1.1 材料

卵巢浆液性囊腺癌细胞株SKOV3购自美国菌种保藏中心(American Type Culture Collection)。细胞培养基RPMI-1640、Opti-MEM购自美国Gibco公司，胎牛血清购自杭州四季清公司。脂质体LipofectamineTM2000、TRIzol均购自美国Invitrogen公司。RT-PCR试剂盒购自美国Fermants公司。HOXB7兔抗人多克隆抗体购自美国ZYMED公司；兔抗人Cyclin D1和Cyclin E多克隆抗体购自美国Neomarkers公司；GAPDH鼠抗人单克隆抗体购自上海康成生物工程有限公司；HRP标记羊抗兔、羊抗鼠IgG购自上海奇康生物科技公司。质粒pRNAT-U6.1/Neo购自美国GenScript公司。

1.2 方法

1.2.1 HOXB7siRNA表达载体构建

HOXB7siRNA由载体pRNAT-U6.1/Neo质粒介导。根据siRNA设计原则和HOXB7基因mRNA编码序列，选定特异性的HOXB7siRNA序列：AGAGTAACTTCCGGATCTA(GenBank编号NM_004502，362～380 bp)。对于选定的siRNA序列，合成两条DNA模版单链，且每条单链均由siRNA的正义链与反义链组成。同时设计一条经BLAST与现有基因文库中所有人源基因均无同源性的非特异性序列(5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’)作为阴性对照。分别将根据每个序列合成的2条DNA模板单链退火后，插入空质粒构建成重组质粒。重组质粒分别命名为pRNAT-hoxb7、pRNAT-neg(作为阴性对照)。经上海博亚公司测序，鉴定正确后用于细胞转染。

1.2.2 细胞培养及转染

SKOV3细胞在37 ℃，CO2体积分数为5%的条件下，培养于含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液中，以0.25%胰酶消化、传代。

将培养的SKOV3细胞分3组：第1组为细胞未作转染处理(空白组)；第2组为细胞转染阴性质粒pRNAT-neg(阴性对照组)；第3组则为细胞转染干扰质粒pRNAT-hoxb7(pRNAT-hoxb7干扰组)。转染前1天将SKOV3细胞接种于24孔板中，转染时细胞汇合至70%～80%时，按LipofectamineTM2000说明书的步骤分别转染干扰质粒pRNAT-hoxb7、阴性对照质粒pRNAT-neg。24 h后，用0.2%胰蛋白酶消化，1∶10传代于6.0 cm孔板中，48 h后用荧光显微镜观察转染后细胞荧光蛋白表达情况。高倍镜下计数100个细胞计算细胞转染阳性率。

1.2.3 RT-PCR检测

分组同细胞转染，SKOV3细胞在转染72 h后，各组取1×106个细胞按照TRIzol说明书提取细胞总RNA，紫外分光光度仪定量。取4 μg总RNA按试剂盒步骤逆转录为cDNA，再用不同引物进行PCR反应。HOXB7上游引物：5’-AGAGTAACTTCCGGATCTA-3’，下游引物 5’-TCTGCTTCAGCCCTGTCTT-3’；扩增产物为274 bp。GAPDH上游引物：5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’；下游引物：5’-CCACCACCCTGTTGCTGTAG-3’，扩增产物为450 bp。PCR的反应条件为：94 ℃变性5 min；94 ℃ 60 s、55 ℃ 60 s、72 ℃ 60 s，共30个循环；72 ℃延伸10 min；反应体系用 GAPDH作为内参照， PCR产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。Touching凝胶成像系统分析条带灰度值，以HOXB7与GAPDH条带灰度值的比值作为HOXB7mRNA的相对表达水平。

1.2.4 蛋白质印迹法(Western blot)检测

分组同细胞转染，SKOV3细胞在转染72 h后，蛋白裂解液裂解细胞并提取总蛋白，金鸡钠酸(bicinchonininc acid)法定量。30 μg蛋白经SDS-PAGE胶分离后，转移至硝酸纤维素膜上，室温封闭1 h，加入HOXB7多抗(1∶200)、Cyclin D1多抗(1∶200)、Cyclin E多抗(1∶200)、GADPH单抗(1∶10 000)，4 ℃温育过夜，次日加入HRP标记的羊抗兔、羊抗鼠二抗37 ℃温育1 h。采用增强化学发光法(enhanced chemiluminescene，ECL)显影。Touching凝胶成像系统分析条带灰度值，并与GAPDH相比较计算相对表达水平。

1.2.5 BrdU检测细胞增殖

分组同细胞转染。SKOV3细胞在转染72 h后，用10 nmol的BrdU标记细胞1 h，4%多聚甲醛室温固定20 min。用2N的HCl 37 ℃处理1 h，0.1 mol/L的硼酸钠(NaB4O7)室温处理30 min，0.1%TritonX-100室温处理2 min，10%小牛血清室温下封闭1 h，加入BrdU单抗(1∶500)，4 ℃温育过夜，次日再加入羊抗鼠二抗37 ℃温育1 h，DAB显色5 min，置显微镜下观察。以细胞核呈黄色/棕黄色染色为阳性染色(为进行DNA合成的细胞)。每张片子随机取5个高倍视野(×200)，计数阳性细胞所占的比例。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞周期和细胞凋亡

分组同细胞转染。SKOV3细胞在转染72 h，并经消化、离心后(200×g，5 min，离心机型号：GB12258-1990)收集获得，用70%冷乙醇4 ℃固定过夜。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗2次重悬细胞，加入500 μg/mL的PI和10 mg/mL的RNA酶A，37 ℃避光染色30 min，过滤后在流式细胞仪上检测，每组检测10 000个细胞，流式细胞仪自动检测出每个细胞所处的细胞周期并分别计算出G1期、S期和G2/M期的细胞所占的百分比。

转染72 h后弃上清液，冰预冷的1×PBS洗涤细胞2次，离心2 min后收集细胞，以1×106/ mL的浓度重悬于1×结合缓冲液中。取100 μL细胞悬液(1×105细胞)加入到5 mL的离心管中，分别加入5 μL Annexin Ⅴ-FITC和5 μL PI；轻轻振荡混匀，室温暗室温育15 min。每管加入400 μL的 1×结合缓冲液，混匀，立即用流式细胞仪进行分析。结果分析：未凋亡的活细胞［AnnexinⅤ(-)/PI(-)］，早期凋亡细胞［AnnexinⅤ(+)/PI(-)］，晚期凋亡细胞和坏死细胞［AnnexinⅤ(+)/PI(+)］，机械损伤的细胞［AnnexinⅤ(-)/PI(+)］。本研究中，［AnnexinⅤ(+)/PI(-)］的细胞被认为是凋亡细胞，即早期凋亡细胞［14］。

1.3 统计学处理

所有研究均设3份平行试验，采用SPSS 11.5软件对上述结果进行分析，统计数据以表示，同组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 细胞转染情况

质粒中含有编码GFP的基因，故转染干扰质粒pRNAT-hoxb7到SKOV3细胞12 h后荧光显微镜下即可见绿色荧光细胞。48 h荧光达到明亮状态，转染48 h后荧光细胞阳性率为(80.5±3.5)%。

2.2 RNA干扰后HOXB7mRNA及蛋白抑制情况

SKOV3细胞分别经阴性质粒pRNAT-neg、干扰质粒pRNAT-hoxb7转染后，RT-PCR、Western blot方法检测SKOV3细胞HOXB7mRNA和蛋白表达。结果显示：①与空白组相比，阴性对照组细胞HOXB7 mRNA的表达无明显变化，但pRNAT-hoxb7干扰组细胞HOXB7 mRNA的表达明显下降，吸光度为阴性对照质粒组的19%(图1A)；②Western blot结果显示，pRNAT-hoxb7干扰组细胞HOXB7 蛋白表达情况与mRNA表达一致，半定量分析表明，其蛋白表达量仅为阴性对照组的29%(图1B)。

图 1 转染HOXB7siRNA到SKOV3细胞后HOXB7mRNA和蛋白表达变化Fig. 1 Transfection with HOXB7 siRNA plasmids(pRNAT-hoxb7) to knonck down HOXB7 gene in SKOV3 cell line

2.3 RNA干扰后，SKOV3细胞增殖率的改变

采用BrdU法分别检测SKOV3细胞空白组、阴性对照组、pRNAT-hoxb7干扰组细胞增殖率的变化。BrdU阳性的细胞核呈均一的棕黄色，为增殖的细胞，而BrdU阴性的细胞核则被苏木素复染为蓝色。计数5个高倍镜视野中阳性细胞所占百分比即代表各组细胞的增殖率。结果显示，pRNAT-hoxb7干扰组的SKOV3细胞增殖率为(22.78±2.08)%，明显低于空白组(35.40±1.95)%和阴性对照组(33.13±2.19)%，差异有统计学意义(P＜0.05)。

2.4 干扰HOXB7表达后对人卵巢癌细胞系SKOV3细胞周期的影响

应用流式细胞仪分析细胞的细胞周期。结果显示，与空白组和阴性对照组相比，pRNAT-hoxb7干扰组G1期细胞所占比例增加，而S期细胞所占比例减少，且差异有统计学意义(P＜0.01，表1)。

表 1 流式细胞仪检测RNA干扰前后卵巢癌SKOV3细胞周期的变化Tab. 1 Effects of HOXB7 depletion on SKOV3 cell cycle distribution

2.5 干扰HOXB7表达后SKOV3细胞中Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表达变化

为进一步研究RNA干扰HOXB7基因引起SKOV3细胞S期变化的机制，本研究采用Western blot法检测了与细胞增殖和细胞周期有关的Cyclin D1和Cyclin E蛋白在各组细胞中的表达情况，结果发现，与空白组和阴性对照组相比，pRNAT-hoxb7干扰组Cyclin D1和Cyclin E蛋白表达水平显著下降，差异有统计学意义(P＜0.05)；而内参照GAPDH在各组中的表达水平相似(图2)。

2.6 HOXB7 siRNA对SKOV3细胞凋亡的影响

细胞凋亡时，膜磷脂中的磷脂酰丝氨酸(phosphatidylserine，PS)从细胞膜的内表面移到外表面，AnnexinⅤ与PS有高度的亲和力，因而能识别凋亡细胞。PI是流式细胞仪分析的显色剂。本研究中SKOV3细胞用AnnexinⅤ和PI双染色，通过流式细胞仪分析细胞的凋亡。结果显示，pRNAT-hoxb7干扰组的SKOV3细胞凋亡率为(5.54±0.61)%，高于空白组(2.50±0.59)%和阴性对照组(3.33±0.25)%，差异有统计学意义(P＜0.05，图3)。

图 2 Western blot 检测HOXB7 siRNA作用后，ES-2、SKOV3细胞中Cyclin D1和Cyclin E蛋白的表达变化Fig. 2 Western blot analysis of Cyclin D1 and Cyclin E after transfection of siRNA for 72 h

图 3 流式细胞仪检测RNA干扰HOXB7后ES-2、SKOV3细胞凋亡的变化Fig. 3 The effects of siRNA on apoptosis of SKOV3 cells in the lower right quadrant [Annexin V(+)/PI(-)] were viable apoptosis cells

3 讨 论

卵巢浆液性囊腺癌占卵巢恶性肿瘤的40%～50%，恶性程度较高、易发生转移、预后差，目前对其发生的分子机制尚不完全明了。近年有文献报道了作为胚胎发育主控基因的HOX基因参与了卵巢肿瘤的发生。如HOXA7与高分化卵巢癌或癌肿早期发生有关，可作为卵巢癌早期诊断的标志［15］；HOXA9、HOXA10、HOXA11可能与诱导上皮性卵巢癌向不同病理类型分化(浆液性、内膜样、黏液性)有关［16］。

HOXB7基因属同源异型盒基因HOX家族，定位于染色体17q21.3。目前，HOXB7基因与卵巢癌关系的研究尚少，Naora等［13］用SEREX方法检测卵巢正常上皮，卵巢浆液性囊腺癌，内膜样癌患者血清中HOXB7表达及Western blot检测相应组织中HOXB7蛋白质表达，提示HOXB7在上述肿瘤组织中高表达；将HOXB7正义质粒转染入卵巢永生化上皮细胞中，细胞增殖率增加3倍，同时伴随细胞分泌碱性成纤维因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)增多，提示HOXB7基因可能是通过转录上调bFGF分泌进而促进卵巢表面上皮细胞的增生。

为研究 HOXB7基因与卵巢癌细胞周期及相关机制，本部分实验选择了阳性表达HOXB7基因的卵巢浆液性囊腺癌细胞SKOV3。应用pRNAT-U6.1/Neo质粒构建HOXB7siRNA表达载体，并转入到上述细胞中；经RT-PCR和Western blot技术验证，其能有效阻断HOXB7基因的表达。随后，采用BrdU法和流式细胞仪分别检测干扰前后细胞增生能力及细胞周期的变化，以观察HOXB7基因对卵巢浆液性囊腺癌体外细胞增生的影响。结果显示，RNA干扰使HOXB7基因表达沉默能够显著抑制SKOV3细胞的增殖，并且使其S期细胞比例下降，G1期细胞比例增加，细胞周期阻滞在G1期。

为了进一步探讨HOXB7基因沉默导致细胞生长受抑和G1期阻滞的机制，本研究检测了在细胞增殖和细胞周期调控中起主要作用的Cyclin D1和Cyclin E蛋白在HOXB7基因干扰前后的表达变化。Cyclin D1和Cyclin E都是G1期相关的细胞周期蛋白，在G1/S期转变过程中起重要作用［17］。正常细胞的增殖分化有赖于细胞有序的周期活动，Cyclin D1定位于染色体11q13，与CDK4/CDK6结合而形成复合物，使Rb发生磷酸化而与E2F分离，驱动细胞由G1期进入S期，促进细胞增殖。当Cyclin D1或CDK4/CDK6表达失控时，可能导致细胞增殖周期失调，肿瘤发生。Cyclin E定位于染色体19q12～19q13，与细胞周期素依赖性激酶2(CDK2)结合并使之激活，在G1晚期调控和G1/S期转换过程中起关键作用，可促使细胞由G1期进入S期。Cyclin E异常表达可使CDK2持续激活，细胞周期失控而导致肿瘤发生。许多恶性肿瘤均有Cyclin D1、Cyclin E的高表达，如乳腺癌、肝癌、头颈部肿瘤等，卵巢癌亦不例外［17］。本研究发现干扰HOXB7基因后，SKOV3细胞中的Cyclin D1和Cyclin E表达水平明显降低；提示在卵巢癌中，RNA干扰HOXB7基因表达所致细胞增生能力下降可能与Cyclin D1和Cyclin E降低有关，但具体通过何途径调节尚需进一步研究。

目前有关HOXB7基因与卵巢癌凋亡关系的研究尚鲜见报道。本研究应用流式细胞仪检测了RNA干扰HOXB7基因对卵巢癌SKOV3细胞凋亡的影响。结果显示，RNA干扰使HOXB7基因表达沉默，促进卵巢癌SKOV3细胞凋亡，但具体机制尚待进一步研究。

综上所述，本研究结果表明，HOXB7基因在卵巢浆液腺囊腺癌细胞株中呈阳性表达；应用构建真核表达载体的RNA干扰技术能特异并有效地沉默HOXB7基因的表达，为研究其功能提供了一个理想的技术平台；阻断HOXB7基因在卵巢癌中表达可抑制卵巢癌细胞的恶性增殖，促进其凋亡，且抑制卵巢癌细胞的恶性增殖可能与下调细胞周期相关蛋白Cyclin D1和Cyclin E的表达有关，为进一步开展卵巢癌的基因治疗奠定了基础。另外，涉及肿瘤发生、发展的基因和影响因素决不是单一的，为了更好地了解HOXB7在卵巢癌发生、发展中的作用，有必要进一步研究HOXB7与其他调节增殖、侵袭相关基因之间的关系。

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Silencing of HOXB7 by RNAi influences proliferation and relative mechanism of ovarian serous adenocarcinoma cell line SKOV3

ZHAO Yu-qing1, HUANG Yan2, GAO Shu-jun1, FENG You-ji3(1. Department of Gynecology and Obstetrics, Gynecologic and Obstetric Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China; 2. Department of Gynecologic Oncology, Fudan University Shanghai Cancer Center, and Department of Oncology, Shanghai Medical College, Fudan University, Shanghai 20032, China; 3. Department of Gynecology and Obstetrics, Shanghai First People’s Hospital, Shanghai 20080, China) Correspondence to: FENG You-ji E-mail: fengyj4806@sohu.com

Background and purpose: The expression of HOXB7 gene was higher expressed in ovarian cancer and may be involved in the cellular malignant transformation.This study used the sequence-specific siRNA knocking down the expression of HOXB7 gene and aimed to investigate its effect on cell proliferation and relative mechanism of ovarian serous adenocarcinoma cell line SKOV3. Methods: SKOV3 cells were divided into 3 groups: untreated control group, non-specific siRNA group transfected with unrelated siRNA (pRNAT-neg) and HOXB7siRNA groups transfected with HOXB7s-iRNA (pRNAT-hoxb7). RT-PCR, Western blot were used to examine the HOXB7mRNA and protein expression. Cell cycle and apoptosis were analyzed by flow cytometry. We further investigated the expression of Cyclin D1, Cyclin E by Western blot, which were critical in regulating cell proliferation. Results: The pRNAT-hoxb7 siRNA had high inhibition for HOXB7 gene (P＜0.01). HOXB7 RNAi could also arrest of G1cell cycle, induce inhibition of cell proliferation and increase apoptosis rate. Western blot showed the expression of Cyclin D1, Cyclin E decreased after HOXB7 expression downregulated. Conclusion: Down-regulated HOXB7 expression could inhibit the expression of Cyclin D1, Cyclin E and thus is involved in the G1arrest and may increase the apoptosis rate of SKOV3 cells.

Ovarian neoplasms; Homeobox gene; Proliferation; Cell cycle; Cyclin D; Cyclin E

10.3969/j.issn.1007-3969.2013.03.003

R737.31

：A

：1007-3639(2013)03-0173-06

2012-12-19

2013-03-01）

丰有吉 E-mail:fengyj4806@sohu.com