当归补血汤加味对GK大鼠血-视网膜屏障保护作用的实验研究

郭艺娟，高德宏，刘素嬛，李学军，杨叔禹

(厦门大学附属第一医院，厦门 361003)

糖尿病视网膜病变(DR)的实质是微血管病变，早期病理改变主要包括选择性毛细血管周细胞丧失、毛细血管基底膜增厚、内皮细胞增生、微血管瘤的形成等。而视网膜细胞丧失导致的血-视网膜屏障破坏及血管通透性的增高是糖尿病视网膜微血管病变最早期的特征之一，血-视网膜屏障损伤使得液体或血液从血管渗透到视网膜，引起视网膜肿胀[1]，从而导致 DR 的发生。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

伊凡思蓝(Sigma公司生产)，柠檬酸(上海阿拉丁试剂有限公司生产)，多聚甲醛(上海试剂总厂经贸公司生产)，甲酰胺(上海阿拉丁试剂有限公司生产)，戊巴比妥钠(上海索莱宝生物科技有限公司生产)。

血糖仪(美国强生公司生产)，超声波细胞粉碎机(美国Sonics公司生产)，手术显微镜(深圳市叁诺西努科技有限公司生产)，超高速冷冻离心机(美国Beckman Coulter公司生产)，超微量分光光度计(Thermo Scientific公司生产)。

1.2 实验动物

24周龄 SPF级雄性 GK大鼠，体质量 280g～350g，购自上海斯莱克实验有限公司(许可证号:SCXK(沪)2007-0005)。将其随机分为模型组、导升明组、中药低剂量组、中药高剂量组4组，每组各15只。清洁级雄性Wistar大鼠设为正常对照组，购自北京维通利华实验技术有限公司(许可证号SCXK(京)2006-0009)。分笼饲养，饲养条件保持在室温18℃ ～25℃，空气流通，相对湿度为体积分数55%～70%，12h光照维持，昼夜循环。动物在笼中自由摄食饮水。饲料为大鼠全价颗粒饲料，由厦门大学实验动物中心提供。每日相对固定时间灌胃1次，连续灌胃3个月。

1.3 给药方法

正常对照组:正常饮食，不灌胃;模型组:用与中药组等体积的蒸馏水灌胃;导升明对照组:用相当于临床用药量10倍的导升明混悬液灌胃;中药低剂量组:用相当于临床用药量5倍的中药灌胃;中药高剂量组:用相当于临床用药量20倍的中药灌胃。

1.4 血-视网膜屏障损害的检测

暴露大鼠尾静脉，EB 45mg/kg在1min内由静脉缓慢注入。循环120min后，1%戊巴比妥纳麻醉后，将预热至37℃，以 pH 3.5、0.05mol/L的柠檬酸缓冲液稀释的1%多聚甲醛缓冲液，由左心室灌注，同时剪开右心耳，灌注压力 120mmHg，灌注时间2min。灌注结束后，立即取出眼球，分离视网膜，45℃ 真空晾干5h，称重。将视网膜与300μL甲酰胺在70℃下孵育18h，然后将提取液移入超滤离心管，离心机在4℃、40000r/min下超高速离心20min。取上清液1ul用超微量分光光度计测其吸光度(A)值，测定623nm(参考波长740nm)波长下样品的吸光度值之差(净吸光度值)，净 A值 =A623－A740，建立EB染料浓度在甲酰胺中的标准曲线。每一样品测量6次，最后取其平均值。用视网膜干重(mg)标准化EB(ng)含量，结果表示为:ng/mg。

1.5 统计方法

应用SPSS 13.0统计软件分析，计量资料采用均数±标准差(s)表示，2组比较，行两样本均数比较的t检验;多组比较行单因素方差分析。

2 结果

2.1 各组大鼠的血糖、血脂情况

表1显示，通过对治疗后GK大鼠的血糖进行检测，模型组及各治疗组血糖高于正常对照组(P＜0.05);对模型组及各治疗组血糖比较差异无统计学意义(P＞0.05);通过对GK大鼠的血脂进行检测，模型组及各治疗组总胆固醇处在较高水平，与正常对照组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，对模型组及各治疗组甘油三酯比较差异无统计学意义(P ＞0.05)。

表1 各组大鼠的血糖、血脂情况(s，mmol/L)

表1 各组大鼠的血糖、血脂情况(s，mmol/L)

注:与正常对照组比较:*P＜0.05

组别 血糖(mmol/L)总胆固醇(mmol/L)甘油三酯(mmol/L)正常对照组0.982±0.353 6.272±0.856 1.486±0.143 0.953±0.242模 型 组19.718±3.897*2.527±0.214*1.003±0.445导 升 明 组21.798±2.976*2.693±0.260*0.910±0.454中药低剂量组 20.930±6.851*2.420±0.228*0.772±0.335中药高剂量组 18.510±7.319*2.422±0.108*

2.2 各组大鼠视网膜组织的EB渗透量

使用分光光度计进行标准溶液的全程光谱扫描，找到伊凡思蓝在甲酰胺中的最大吸收波长为623nm，选取参考波长为 740nm，以623nm～740nm波长对配好的已知浓度的标准溶液进行扫描，可以测定出标准溶液的吸收光度值，用得到的吸收光度值和浓度作直线拟合，得到直线回归方程:y=13.692x－0.0026，x表示净吸光度值，y表示伊凡思蓝在甲酰胺中的浓度。

表2显示，与正常对照组比较，模型组大鼠视网膜组织中EB的渗透量明显增加了3.8倍，差异有统计学意义(P＜0.05)。经导升明及中药治疗后，视网膜组织中EB的渗透量下降，导升明组、中药低剂量组、中药高剂量组分别降低了43.5%、37.4%、51.7%。其中，导升明组、中药低剂量组中EB的渗透量有下降趋势，但与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05);中药高剂量组EB的渗透量与模型组比较差异有统计学意义(P＜0.05)，与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。

表2 各组大鼠视网膜组织的EB渗透量(s，ng/mg)

表2 各组大鼠视网膜组织的EB渗透量(s，ng/mg)

注:与正常对照组比较:*P＜0.05，＊＊P＜0.01;与模型组比较:△P＜0.05

组别眼数s(ng/mg)3.166±1.375模 型 组 10 12.147±4.546＊＊导 升 明 组 5 6.866±1.014*中药低剂量组 10 7.600±1.937＊＊中药高剂量组 6 5.866±2.397正常对照组6△

3 讨论

本实验所采用的GK大鼠为自发性2型糖尿病动物模型，是对正常Wistar种系大鼠进行口服葡萄糖耐量试验并筛选出高血糖的个体培育出的一种原发性非肥胖性的2型糖尿病模型，主要表现为非肥胖性、胰岛素抵抗、胰岛素分泌不足等人类2型糖尿病的特征。同时由于GK大鼠血糖比较稳定且死亡率极低，因而常被用于糖尿病及其并发症的研究，故此本研究选用之。

GK大鼠尾静脉注射伊凡思蓝后，随着血液循环伊凡思蓝可到达视网膜血管。倘若血-视网膜屏障被破坏，可引起血管通透性增加，血管内液体及白蛋白等大分子就会渗漏到组织间隙。本实验采取尾静脉注射EB并循环2h后，通过检测由视网膜毛细血管内渗漏到组织间隙的EB含量，可以比较精确地发现早期糖尿病大鼠视网膜病变中血-视网膜通透性的改变。张富文[2]采用 STZ大鼠观察血-视网膜屏障的变化发现，造模后2周、1月、2月、3月、4月、5月和6月存在着明显的视网膜渗漏情况，与正常对照组比较差异显著，且随病程的增加渗透量逐渐增多，造模后3月有明显增多的趋势，造模后6月组织渗透量约为24.7ng/mg。本实验 9月(36周龄)GK大鼠的组织渗透量约为12.2ng/mg，较 STZ大鼠渗透量低，考虑与大鼠的种属及血糖情况有关。而本实验中通过与正常对照组比较，GK大鼠的EB含量显著增加，差异有统计学意义。由此可见，36周龄的GK大鼠存在着明显的血-视网膜屏障损伤。

本研究采用当归补血汤加味治疗GK大鼠，其EB含量与模型组比较显著下降，由此说明当归补血汤加味对血-视网膜屏障的渗漏有一定的保护作用。血-视网膜屏障能够保证血液在血管中的正常运行及营养物质的正常输送，防止血管内物质外渗。而中医认为，气的固摄作用包括气对血、津液、精液等液态物质的统摄，防止其无故流失。若气的固摄作用减弱可导致血管内血液溢出脉外，因而血-视网膜屏障紧密连接的破坏可以认为是气的固摄作用减弱的一种表现。而气虚则化生血液的功能减弱，易于出现血虚的病变;气虚则气的推动作用亦不足，则可见血运迟缓甚或停滞脉中，易于出现血瘀的病变，从而形成气血亏虚、血瘀络阻的病理特点。我们采取益气养血、活血通络的当归补血汤加味进行治疗，发现其对GK大鼠血-视网膜屏障的损伤具有保护作用。

[1]Harhaj N S and Antonetti D A.Regulation of tight junctions and loss of barrier function in pathophysiology[J].International Journal of Biochemistry and Cell Biology，2004，36(7):1206-1237.

[2]张富文.中药部位复方DGH对STZ诱发糖尿病大鼠血视网膜屏障和视功能影响的实验研究[D].四川:成都中医药大学，2005:40.