马蹄香对仔猪大肠杆菌的抑菌效果观察

管庆松 袁雪波 项 勋 代飞燕* 肖 啸（云南农业大学动物科学技术学院 云南 昆明 650201云南省红河州动物疫病预防控制中心 云南 蒙自）

马蹄香(Valeriana jatamansi Jones)又名蜘蛛香、土细辛、印度缬草等，系败酱科缬草属植物。马蹄香生于土壤潮湿、富含有机质的地方，常见于海拔1800～2500m疏林或灌木林下或溪沟、田埂边。云南全省及四川、贵州、陕西等省有分布[1]。马蹄香首载于《本草纲目》，《滇南本草》中亦有记载，是云南地区常用的药物之一。云南民间用其治疗心腹疼痛、风湿麻木及筋肉酸痛等[2]。马蹄香用于治疗胃肠道疾病有较好的疗效，如消化不良，呕吐腹泻，小儿疳积，腹胀，食少，胃气痛等[3]。其化学成分主要含挥发油、环烯醚萜类、黄酮类等多种成分[4,5]。大肠杆菌病是一种重要的人畜共患病，该病的病原为致病性大肠埃希菌。对猪大肠杆菌病的治疗，养猪户大多采用抗生素和抗菌类药物。但不合理用药加速了猪大肠杆菌耐药性的产生和扩大，给该病的防治带来困难[6]。本试验用马蹄香提取物对分离鉴定的仔猪肠道大肠杆菌菌株进行体外抑菌试验，观察马蹄香提取物对大肠杆菌的抑菌效果，为云南马蹄香资源的利用和猪致病性大肠杆菌的防治提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 病料的采集 在昆明富民恳宁养猪场，无菌采取发病仔猪直肠深部的粪便及其肠内容物各2份，每份约0.5g。

1.1.2 试验器材 生物显微镜、托盘天平、恒温培养箱、超净工作台、蒸汽灭菌器、接种环等。

1.1.3 培养基及试剂 麦康凯琼脂平板、普通琼脂平板、伊红美蓝琼脂平板、普通琼脂斜面、肉汤培养基、三糖铁培养基、靛基质试剂、吲哚试剂等。

1.1.4 试验动物 健康昆明种小鼠10只，分成试验和对照2个组，每组5只。

1.1.5 受试药物 马蹄香，购于昆明市菊花村中草药集市，经过药材市场专门加工机加工成马蹄香粗粉。庆大霉素、链霉素、林可霉素、头孢氨苄等。

2.2 大肠杆菌分离及马蹄香提取

2.2.1 大肠杆菌分离 分离培养、分离菌生化试验、形态观察及动物致死性试验参照方定一[7]方法进行。

2.2.2 马蹄香药液提取制备 取马蹄香粗粉10g，于圆底烧瓶中，加入95%乙醇100ml，水浴回流1h，冷却，过滤得滤液A。在盛有药渣的烧瓶中加无菌蒸馏水100ml，水浴回流1h，冷却，得滤液B，将两滤液混合，减压浓缩呈浸膏，加无菌蒸馏水稀释至1g/ml的马蹄香提取液。

2.3 体外抑菌试验

2.3.1 纸片扩散法 将马蹄香提取液分别稀释、浓缩成0.25、0.5、1、2、4g/ml的药液浓度，每种药液分别用灭菌纸片(直径6mm)浸透，将含马蹄香的灭菌纸片平置于已经涂布好的大肠杆菌平板表面，置于37℃培养24h后取出，测量各纸片周围抑菌圈直径。并在另一块涂布好的大肠杆菌平板表面平置庆大霉素、链霉素、林可霉素、头孢氨苄、头孢曲松钠的标准药敏纸片以作对比。

2.3.2 牛津小杯法 将经过高压灭菌后的牛津小杯竖立放置于已经与涂布好的大肠杆菌平板表面上，每个小杯中分别加入0.25、0.5、1、2、4g/ml浓度的药液0.2ml，37C培养24h，以抑菌圈直径评定药物的抑菌作用。

2.3.3 平皿法 马蹄香提取液按无菌法依次稀释成0.2g/ml、0.1g/ml、0.05g/ml、0.025g/ml和0.0125g/ml。分别将已稀释药液与10ml普通营养琼脂培养基充分混匀，制成含药物的平板培养基，其含马蹄香的浓度分别为0.02、0.01、0.005、0.0025和0.00125g/ml。用接种环蘸取1:1000的大肠杆菌悬液，以划线接种于上述含药平板内，37℃培养24h，观察细菌在不同浓度药物平板上生长情况，细菌不生长的最低浓度即为该药物对该菌的最小抑菌浓度(MIC值)。

2 结果与分析

2.1 培养特性

在普通琼脂平板上生长的菌落光滑、灰白、湿润、圆形、边缘整齐、稍有隆起；麦康凯琼脂平板上生长的菌落圆形、红色、边缘整齐；伊红美蓝琼脂平板上形成黑色带金属光泽的菌落；普通肉汤中可观察到肉汤变浑浊，底部有絮状物沉淀。

2.2 形态特征

细菌涂片，革兰氏染色，光镜检查，可见该菌为两端略显钝圆的中等大小杆菌、散在或成对存在、两端着色较深、革兰氏染色阴性。

2.3 生化特性

三糖铁试验中，培养液呈现黄色，并伴有气泡产生；吲哚试验中，培养液呈现红色；甲基红试验中，培养液呈现红色。生化试验结果符合大肠杆菌的特征。

2.4 动物致死性试验

24h内，试验组5只小鼠除1只发病未致死外，其余4只全部死亡，发病率100%，致死率80%，而对照组小鼠正常。由此证明本次分离的大肠杆菌为致病性大肠杆菌，并具有高致病性。

2.5 体外抑菌试验

2.5.1 纸片扩散法和牛津小杯法法试验结果

表1 纸片扩散法药敏试验结果（mm、g/ml）

由表1可知，中药马蹄香在0.25、0.50、1.00、2.00、4.00g/ml不同浓度时，通过纸片扩散法测得抑菌圈直径分别为7.2、7.5、8.4、10.2、13.4mm。经牛津小杯法测得的抑菌圈直径分别为10.8、13.0、15.6、18.0、20.2mm。随着中药马蹄香药提取液浓度的增加，抑菌圈直径增大。同时，对比5种抗生素的抑菌圈直径，高浓度的马蹄香提取液抑菌效果与部分抗生素接近。

2.5.2 平皿法实验结果 平皿试验中，0.02g/ml浓度的马蹄香提取液的平皿中无细菌生长，而0.01g/ml的平皿中看到有少量菌落散在生长，0.00125、0.0025、0.005g/ml的平皿上有大量大肠杆菌菌落生长，因此确定中药马蹄香提取液的最小抑菌浓度MIC值为0.02g/ml，稀释度为1:50。

3 讨论

猪大肠杆菌病是由致病性大肠杆菌引起的一类仔猪肠道传染性疾病的总称，是仔猪的一种常见病和多发病。长期以来，该病的防治主要依靠抗生素等化学药物。然而，抗生素等药物的大量使用引起药物残留和细菌、病毒产生耐药性，进一步加大疾病控制的难度。本试验中，根据细菌形态特征、培养特性、生化特性及动物致病性试验，确定从发病仔猪的粪便、肠内容物中分离的细菌为致病性大肠杆菌。体外抑菌试验结果表明，中药马蹄香对仔猪致病性大肠杆菌具有较强的抑制作用，抑菌效果随着药液浓度的升高呈现高效性，其最小抑菌浓度MIC值为0.02g/ml。另外，药敏纸片法结果分析发现，仔猪大肠杆菌的抑菌效果从大到小顺序为庆大霉素>头孢氨苄>链霉素=头孢曲松钠>高浓度马蹄香药液>中浓度马蹄香药液>低浓度马蹄香药液>林可霉素。马蹄香提取液对大肠杆菌的抑菌作用随浓度的升高而效果增强，虽抑菌效果比庆大霉素、头孢氨苄稍差，但接近于林可霉素和链霉素。王珊等(2011)[8]研究表明：马蹄香对犬细小病毒性肠炎有较好治疗效果。马静等( 1987)[9]研究显示，马蹄香是治疗小儿轮状病毒性腹泻的有效药物，马蹄香煎剂及散剂都能使肠蠕动受到抑制，可缩短肠炎腹泻时间。Wang等(2008)[4]报道，马蹄香中含有的萜类化合物具有广谱抗菌活性。推测马蹄香可抑制多种肠道细菌的新陈代谢、生长繁殖。本试验结果也证实，马蹄香对猪致病性大肠杆菌有抑菌效果，但作用机理尚不清楚，有待进一步研究。在迫切需要解决抗生素残留和耐药性问题的今天，中药马蹄香的应用效果逐步显现，值得深入研究开发利用。

4 结论

马蹄香药液对仔猪大肠杆菌有很好的抑菌效果，抑菌作用随着药液浓度的升高而呈现高效性。本试验中，马蹄香对仔猪大肠杆菌的最小抑菌浓度为0.02g/ml。

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