附子药酒抗肿瘤初步研究

李鸿儒，赵 贝，杜钢军，刘伟杰，李佳桓，王莹莹

（河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004）

附子为毛茛科植物乌头（Aconitum carmichaelidebx.）子根的加工品。其性大热，味辛、甘，有毒，入心、脾、肾，通行十二经，具有回阳救逆、温里助阳、祛寒止痛的功效。用于亡阳虚脱、肢冷脉微、阳痿、宫冷、心腹冷痛等症，被称为“回阳救逆第一品”。白附子的药理学作用主要有抗炎、镇静、抗惊厥、止痛，并对多种恶性肿瘤具有一定的抑瘤效果［1－5］。为指导临床正确使用附子治疗肿瘤，我们对附子药酒的抗肿瘤作用做了初步探讨。

1 实验材料

1.1 动物与瘤株

动物：健康昆明小鼠，雌性，22～25g，河南省医学实验动物中心提供；瘤株：H22肝癌，河南大学药学院药物研究所实验室昆明小鼠腹水传代保存；小鼠4T1乳腺癌细胞，河南大学药学院药物研究所实验室传代培养提供。

1.2 药品

附子药酒的制备：取附子与黄酒按1∶10的比例浸泡1周。纱布过滤滤液，供实验动物使用；无菌过滤滤液，供细胞实验使用。

1.3 试剂

CK 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；CAT试剂盒（南京建成生物工程研究所）；T－SOD 试剂盒（南京建成生物工程研究所）；DMEM 高糖培养基（索莱宝科技有限公司）；D－hanks缓冲液（上海西唐生物科技有限公司）；MTT（上海秉东实业有限公司）；DMSO（淄博荣悦进出口有限公司）。

1.4 仪器

HDL洁净台（北京东联哈尔仪器制造有限公司）；快速混匀器SK－1（常州国华电器有限公司）；ElX 800酶标仪（美国BIO－IEK）；TDL－508台式离心机（上海安亭科学仪器厂）；LDZX－75KBS立式压力蒸气灭菌锅（上海申安医疗器械厂）；CHA－S恒温振荡器（常州国华电器有限公司）；LGR16－W 高速冷冻离心机（北京京立离心机有限公司）；倒置生物显微镜（南京江南光电集团股份有限公司）；DYY－7C型电泳仪（北京市六一仪器厂）。

2 实验方法

2.1 对小鼠肝癌皮下移植肿瘤的影响

取生长良好的腹水型肝癌昆明小鼠处死，取腹水，加无菌生理盐水稀释至原腹水的6至8倍，调细胞数5×106个／mL的稀释液，于状态良好的小鼠前肢右腋皮下接种0.2mL／只。将接种后的小鼠按体质量平均分为2组，即模型组和附子组，每组10只。模型组灌胃黄酒0.2mL／10g；附子组灌胃附子药酒浸出物0.2mL／10g。2组均为肿瘤接种后即日开始给药，每天早晚2次，灌胃2周。治疗期间1次／d监测小鼠体质量，待肿瘤长出后，用游标卡尺隔天测肿瘤长度和宽度1 次。肿瘤大小按下列公式计算：肿瘤体积（mm3）＝（肿瘤长度×肿瘤宽度×肿瘤宽度）／2。

全程治疗结束后次日处死小鼠，眼球取血，剥离腋部肿瘤、肝脏、脾脏、胸腺，称重、计算肿瘤抑制率及肝脏、胸腺、脾脏指数。

脏器指数（mg／g）＝内脏器官质量（mg）／体质量（g）；肿瘤抑瘤率（%）＝（1－T／C）×100%。

式中：C为模型组，平均瘤重（g）；T为附子组，平均瘤重（g）。

2.2 对荷瘤小鼠血清中CAT、CK、T－SOD 活力的影响

小鼠接种、分组及给药方案同“2.1”。全程治疗结束后次日小鼠眶静脉取血，分离血清，－20℃储存备用。

2.2.1 对血清中CAT 活力的影响 CAT 分解H2O2的反应可通过加入钼酸铵而迅速中止，剩余的H2O2与钼酸铵作用产生一种淡黄色的络合物，在405nm 处测定其生成量，可计算出CAT的活力。

血清中CAT 活力（U／mL）＝（对照管OD 值－测定管OD 值）×271×1／（60×取样量）×样本测试前稀释倍数。式中，取样量为20μL。

2.2.2 对血清中CK 活力的影响 CK 催化三磷酸腺苷和肌酸，生成磷酸肌酸，后者很快全部水解为磷酸。此时三磷酸腺苷和二磷酸腺苷仍稳定，加入钼酸铵可生成磷钼酸，可进一步还原成钼蓝，根据生成无机磷的量可算出酶的活性。

CK 活力（U／mL）＝根据标准曲线计算所得的CK 酶活力×样本测定前稀释倍数。

标准曲线：Y＝7.4491 X－0.0716，其中X为测定管OD－空白管OD。

2.2.3 对血清中T－SOD 活力的影响 采用黄嘌呤氧化酶法测定T－SOD 活力的原理，通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基，后者氧化羟胺形成亚硝酸盐，在显色剂的作用下呈现紫红色，用酶标仪测OD 值。

总SOD 活力（U／mL）＝［（对照管吸光度－测定管吸光度）／对照管吸光度］÷50%×反应系数的稀释倍数×样本测试前的稀释倍数。

2.3 对基质金属酶谱的影响

将剥离的瘤组织进行蛋白提取，用提取的蛋白进行明胶酶谱法电泳实验。酶谱法的基本过程是先将样品进行SDS－聚丙烯酰胺（SDS－PAGE，含质量分数为0.1%的明胶）电泳分离，然后在有二价金属离子存在的缓冲系统中使样品中的基质金属蛋白酶－2（MMP－2）和MMP－9恢复活性，在各自的迁移位置水解凝胶里的明胶，最后用考马斯亮蓝将凝胶染色，再脱色。在蓝色背景下可出现白色条带，条带的强弱与MMP－2和MMP－9活性成正比。复性原理：在电泳过程中，SDS与样品中的MMPs结合（可逆性结合），破坏其氢键、疏水键而使MMPs不能发挥其分解明胶的作用。将胶置于TritionX－100中洗脱，SDS 被TritionX－100结合而去除，从而使MMPs恢复了活性。

2.4 体外实验

2.4.1 对脾淋巴细胞增殖的影响 将小鼠处死，剖腹取脾脏，于培养皿内加D－hanks液，将其研磨制成单细胞悬液。Tris－NH4CL 5mL溶液溶解红细胞后，用DMEM 完全培养液配制成细胞数2×106个／mL的悬液，移液器于48孔培养板内点6孔作为无ConA的模型组，250μL／孔。在细胞悬液中加入1.42mL ConA（0.2g／L），充分混匀后点板，每孔250μL，其中6孔作为有ConA的模型组。将药物稀释成4个浓度，由低到高分别为1.25×10－4、2.5×10－4、5×10－4、1.0×10－3mg／μL，每个浓度均设3个平行孔，250μL／孔。2 组对照孔中加DMEM 培养基250μL／孔。将48孔板放入CO2培养箱（37℃，体积分数为5% CO2）中培养48 h，加入 MTT 250μL／孔，继续培养4h，吸弃MTT，加入DMSO 250μL／孔，混匀，转移至96孔板中，在570nm 处用酶标仪测OD 值。

2.4.2 对小鼠乳腺癌4T1 细胞增殖的影响 取4T1小鼠乳腺癌传代细胞，加3 mL 胰酶消化，振荡摇匀，加入2mL培养基以中和胰酶，离心2次，弃去上清液，加入培养基吹打均匀，在细胞计数板上计数，调整细胞浓度，吹打成单细胞悬液，备用。上述细胞点入96孔培养板，每孔100μL。另设置空白模型组及4个浓度梯度给药组（药物用培养基稀释），每组设置4个平行对照孔，分别加入空白培养基100μL，100倍、200倍、400倍、800 倍稀释药物100μL。置于体积分数为5%CO2的培养箱内37℃条件下培养48h，加入MTT 5g／L，100μL／孔，放置4h，甩出96孔板中溶液，加入DMSO 100μL／孔，混匀。酶标仪于570nm 测OD 值。

抑制率（%）＝（不加药组OD 值－ 加药组OD值）／不加药组OD 值×100%。

2.4.3 检测 用酶标仪在570nm 处测量各孔的吸光度，计算抑制率。

3 统计学处理

4 实验结果

4.1 对荷瘤肝癌小鼠体质量、肿瘤及免疫器官的影响

与模型组比较，给药组瘤质量、胸腺、脾脏指数均减小，见表1、表2；瘤体积减小，见表1；小鼠生长状态良好。附子对小鼠肝癌有一定的抑制作用，抑瘤率为15.65%，P＜0.05。

4.2 对荷瘤小鼠的CAT、CK、SOD的影响

与模型组比较，附子组小鼠的CAT 活力显著性增大（P＜0.01），T－SOD的活力亦增大，CK的活力显著性减小（P＜0.01），见表3。

表1 附子对H22肝癌荷瘤小鼠瘤体积的影响（，n＝10）

表2 附子对H22肝癌荷瘤小鼠免疫器官及瘤质量的影响（，n＝10）

表3 附子对荷瘤小鼠CAT、CK、SOD的影响（，n＝10）

4.3 对小鼠脾细胞、4T1乳腺癌细胞增殖的影响

与有ConA的模型组比较，不同浓度的附子对小鼠脾淋巴细胞的增殖无影响，见表4；对4T1小鼠乳腺癌细胞无影响，见表5。

表4 附子对小鼠脾细胞增殖的影响

表5 附子对4T1乳腺癌细胞的抑制率

4.4 对基质金属酶谱的影响

与模型组比较，附子组H22肝癌瘤蛋白在72KDa处的电泳条带比较窄，约为模型组的1／3，亮度也比较暗；在92KDa处的电泳条带宽窄、亮度无明显差异，见图1。

图1 明胶酶谱电泳图

5 讨论

近代药理研究表明，附子具有强心、抗心律失常、抗炎、提高免疫力、抗肿瘤等药理活性，其中二萜生物碱类成分被认为是特征性的活性成分［6－7］。实验的抑瘤率为15.65%，显示附子对肿瘤的生长有一定的抑制作用。

免疫系统功能正常与否与肿瘤治疗成败有着重要的关系，免疫治疗本身也是现代肿瘤治疗的一个重要组成部分。实验中，附子组的胸腺及脾脏指数均降低，附子对小鼠脾淋巴细胞的增殖无影响，提示附子的抗肿瘤作用可能不是直接的。

自由基的诱癌、促癌及致癌作用已被公认，其产生和消除失衡与肿瘤的发生、发展关系密切。CAT、T－SOD 属于体内消除自由基的酶类，它们与体内其他酶类及抗氧化剂组成一个自由基的防御系统，以清除过多的自由基［8］。H2O2可引发细胞膜中的不饱和脂肪酸脂质发生过氧化反应，不仅破坏细胞膜，还能诱发细胞凋亡，促使DNA 链断裂，从而损伤细胞，参与多种病理机制［9］。实验结果表明，附子能显著提高CAT的活力，对T－SOD的活力亦有增强作用，降低体内H2O2及超氧阴离子自由基的含量，表现出抗氧化、抗自由基作用，这可能是附子抗肿瘤的机制之一。

恶性肿瘤细胞浸润和转移的过程伴有细胞外基质（ECM ）的降解，基质金属蛋白酶（matrix metalloprote inase，MMP）是引起ECM 降解的主要酶类之一，特别是与肿瘤的侵袭和转移过程密切相关［10－11］。明胶酶（gelatinase）又称Ⅳ型胶原酶，是基质金属蛋白酶家族中的一个重要成员，包括相对分子质量为72000的明胶酶A （MMP－2）和相对分子质量为92000的明胶酶B（MMP－9）。明胶酶不但能降解ECM 成分，还能降解基底膜（basementmember，BM）的主要成分Ⅳ型胶原，而癌细胞发生浸润和转移必须首先穿过BM［12－13］。实验结果表明，附子能使MMP－2的表达显著性增强，可能是肿瘤发生转移的原因。

综上所述，附子有一定的抗肿瘤作用，可以使肿瘤发生转移。其机制主要与抗氧化有关，是否对部分肿瘤可表现为直接抑制作用有待进一步实验研究。

［1］石延榜，张振凌.白附子化学成分及药理作用研究进展［J］.中国实用中医药，2008，3（3）：130－131.

［2］胡长效，朱静，孙晓静.独角莲的化学成分及药理作用研究进展［J］.农业与技术，2007，4（2）：50－51.

［3］段玉敏，刘书鑫，张洪娟，等.独角莲乙醇提取物体外抗肿瘤实验研究［J］.中医药学报，2010，38（3）：20－23.

［4］张红伟.白附子炮制后新增化学成分的研究［D］.郑州：河南中医学院，2009.

［5］马英丽，李艳凤，唐丽萍，等.白附子木脂素化合物调节人胃癌SGC－7901细胞TRAIL及其受体的表达［J］.中国新药杂志，2010，19（3）：225－228.

［6］徐暾海，赵洪峰，徐雅娟，等.四川江油生附子强心成分的研究［J］.中草药，2004，35（9）：964－966.

［7］Zhao C，Li M，Luo Y F，et al.Isolation and structural characterization of an immunostimulating pol－ysaccharide from Fuzi Aconitum carmichaeli［J］.Carbohydr Res，2006，341（4）：485－491.

［8］Estrada Garca L，Carrera Rotllan J，Puig Parellada P.Effects of oxidative stress and antioxidant treatments on eicosanoid synthesis and lipid peroxidation in long term human umbilical vein endo thelial cells culture［J］.Prostaglandins Other Lipid Mediat，2002，67（1）：13－25.

［9］张在兴，孙家邦，李非，等.一氧化氮胰腺保护作用与巯基物质和氧自由基的关系［J］.中华外科杂志，2000，38（12）：928－930.

［10］Lee M，Celenza G，Boggess B，et al.A potent gelatinase inhibitor with anti－tumor invasive activity and its metabolic disposition［J］.Chem Biol Drug Des，2009，73（2）：189－202.

［11］Orimoto A M，Neto C F，Pimentel E R，et al.High numbers of human skin cancers express MMP－2and several integr in genes［J］.J Cutan Pathol，2008，35（3）：285－291.

［12］Roomi M W，Monterey J C，Kalinovsky T，et al.Patterns of MM P－2and MMP－9expression in human cancer cell lines［J］.Oncol Rep，2009，21（5）：1323－1333.

［13］Sampieri C L，Delapena S，Ochoalara M，et al.Expression of matrix meta lloprote inases 2and 9in human gastric cancer and superficial gastritis［J］.Word Gastroero，2010，16（12）：1500－1505.