HPLC法测定不同产地大黄中番泻苷A和番泻苷B的含量

李 勉，丁艳霞，詹传红

（河南大学 药学院，河南 开封 475004）

大黄（Rhubarb）为蓼科植物掌叶大黄、唐古特大黄和药用大黄的干燥根及根茎，是临床常用泻下中药。中国药典（2010年版）对大黄的质量控制以5种游离蒽醌衍生物总量为指标，该项指标反映的是大黄的抗菌成分，测定指标与泻下药效成分无明确对应。研究［1］表明，结合性蒽醌衍系大黄的主要泻下成分中以双蒽酮苷——番泻苷A、B作用最强。测定番泻苷A（sennoside A）、番泻苷B（sennoside B）的方法有分光光度法、薄层扫描法［2］、高效毛细管电泳法［3］、毛细管区带电泳法［4］，这些方法操作流程繁琐，条件要求较苛刻。我们的实验在参照文献［5－7］的基础上，建立了测定大黄药材中番泻苷A和B 含量的HPLC方法，为研究不同产地大黄泻下作用奠定基础，为全面评价大黄品质提供科学依据。

1 仪器与试药

LC－10A型高效液相色谱仪（日本岛津）；KQ5200DB型数控超声波清洗器（北京卓信伟业科技有限公司）；FA1004N 电子天平（上海精密科学仪器有限责任公司）；SHB－Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限责任公司）；甲醇为色谱纯（天津市四友精细化学品有限公司）；所用水为高纯水；其余试剂均为分析纯；番泻苷A和番泻苷B对照品（中国药品生物制品检定所提供）。

市场上随机购买10种大黄作为实验材料，标记样品号为1～10，分别为1号开封北羊市药店大黄，2号巩义市（禹州进货2）大黄，3号开封南羊市药店（内蒙古）大黄，4号开封市天济大药房（内蒙古马蹄）大黄，5号巩义（禹州进货1）大黄，6号安阳市药检所大黄，7号卢氏县药检所大黄，8 号生药实验室大黄，9号安阳市药检所山大黄，10号华北大黄。

2 方法与结果

2.1 对照品溶液制备

精密称取番泻苷A 对照品0.88 mg，番泻苷B对照品0.6mg，置10mL容量瓶中，加入质量分数为0.1%碳酸氢钠溶液使溶解，定容至刻度，配制成含番泻苷A 88mg／L、番泻苷B 60mg／L的混合标准品溶液。

2.2 供试品溶液的制备

取大黄样品粉末，精密称定1.0g，各自加入质量分数为0.1% 碳酸氢钠溶液25 mL，超声提取30min，用普通漏斗过滤得滤液并补足到25 mL，滤液用0.45μm 微孔滤膜过滤，即得供试品溶液。

2.3 色谱条件

色谱 柱：E1718897 Hypersil C18（4.6 mm×250mm，25μm）；流动相：四氢呋喃－水－醋酸（15∶85∶1.5）；流速：0.8 mL／min；检测波长：350nm；柱温：20℃；进样量：20μL。在此色谱条件下番泻苷A和B 分离度良好，不受药材中杂质的干扰，结果见图1、图2、图3。

图1 对照品HPLC色谱图

图2 5号大黄HPLC色谱图

图3 6号大黄HPLC色谱图

2.4 标准曲线及线性关系考察

精密吸取混合标准品溶液2、5、8、10、15、20μL，注入高效液相色谱仪，记录色谱图，并以峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，绘制标准曲线，得到回归方程。番泻苷A：Y＝62517 X －39583，r＝0.9995，说明番泻苷A 在0.176～1.76g／L 范围内呈良好线性关系；番泻苷B：Y＝52532 X－23427，r＝0.9995，说明番泻苷B在0.12～1.2g／L 范围内线性关系良好。

2.5 精密度实验

精密吸取番泻苷A和B混合标准品溶液20μL，按照“2.3”项下进行测定，连续进样6 次，测定峰面积，测得番泻苷A、番泻苷B 峰面积的RSD 分别为1.681%和2.173%。结果表明，仪器的精密度良好。

2.6 重复性实验

精密吸取上述制备好的5 号供试品溶液，按照“2.3”项下进行测定，测得结果为供试品中番泻苷A、番泻苷B 峰面积的RSD 分别为2.21%和1.96%（n＝6）。表明本方法重复性良好。

2.7 稳定性实验

精密吸取上述制备好的5号供试品溶液20μL，分别于0、2、4、6、8、12、24h进样，测得样品中番泻苷A、番泻苷B峰面积值的RSD 分别为2.52%和1.75%。表明供试品溶液在24h内稳定。

2.8 加样回收率实验

精密称取已知含量的样品约1g，6 份，分别加入番泻苷A和番泻苷B适量，按照“2.2”项下供试品制备办法制备供试品溶液，按照“2.3”项下进行测定，计算回收率。结果见表1、表2。

2.9 样品的含量测定

精密吸取供试品溶液各20μL，分别注入高效液相色谱仪，根据供试品的峰面积求得番泻苷A、番泻苷B的含量。结果见表3。

表1 番泻苷A 回收率试验

表2 番泻苷B回收率试验

表3 不同产地大黄中番泻苷A、番泻苷B的含量测定结果（%）

续表3

3 结果与讨论

中国药典2010版对大黄的质量控制为以5种蒽醌苷元总量为指标，测定指标与泻下药效成分无明确对应。通过建立番泻苷高效液相色谱含量测定方法，为大黄的定量分析、品质评价提供了准确有效的分析方法，为国家有关部门制定大黄药材的质量标准提供科学依据。

我们首先对不同来源的10种大黄药材进行简单的显微鉴定，发现安阳市药检所大黄、安阳市药检所的山大黄、华北大黄的显微特征不太明显。进一步通过HPLC法对上述大黄进行番泻苷含量测定，番泻苷总含量分别为0.2073%、0.2538%、0.0696%，巩义（禹州进货1）购买的大黄为0.8431%。

HPLC法测定发现不同来源的各种大黄中番泻苷的含量有较大差异，如巩义（禹州进货1）大黄中番泻苷含量最高，卢氏县药检所提供的大黄及生药实验室大黄中番泻苷含量稍低，而开封北羊市药店大黄、巩义（禹州进货2）大黄、开封南羊市药店（内蒙古）大黄番泻苷含量很低。

［1］中华人民共和国卫生部药典委员会.中华人民共和国药典：一部［S］.北京：化学工业出版社，2005：17－18.

［2］陆春桃，王富.大黄功效索解［J］.四川中医，2006，24（8）：37－38.

［3］刘仁俊，崔晓立.高效液相色谱法测定大黄中番泻苷A 含量［J］.中国卫生工程学，2010，9（4）：306.

［4］李敏，李丽霞，刘渝，等.大黄研究进展［J］.世界科学技术－中医药现代化，2006，8（4）：38－38.

［5］孙佩，李敏，杨小多，等.HPLC 法测定大黄药材和饮片中番泻苷A和番泻苷B的含量［J］.成都中医药大学学报，2008，31（3）：52－56.

［6］陈勇，李文霞.HPLC法测定通便灵胶囊中番泻苷A的含量［J］.西北药学杂志，2006，21（3）：102－104.

［7］吕曙华，吕归宝.HPLC法测定番泻叶中番泻苷A 及番泻苷B的含量［J］.中国药品标准，2002，3（5）：48－50.