槲皮素对小鼠术后肿瘤转移的影响

刘伟杰，王莹莹，李佳桓，杜钢军

（河南大学药学院 药物研究所，河南 开封 475004）

肿瘤是一种基因病，已经成为威胁人类健康的第一大疾病，严重影响患者的生存质量。手术、放疗、化疗是临床上治疗肿瘤的三大有效手段。化疗对患者体内的癌细胞有很强的杀伤作用，可以提高疗效，改善预后，但是，也有很强的不良反应。其中最常见的是骨髓抑制，往往使化疗的疗程和剂量受到限制，导致化疗的失败。

中药在缓解药物的不良反应和增加药物的疗效方面都有明显的作用，并且在诱导肿瘤细胞凋亡和逆转肿瘤细胞的多药耐药方面有明显的作用。槲皮素（quercetin，简称QU，为3，4，5＇，3＇，4＇－五羟基黄酮）及其衍生物是植物界分布最广的黄酮类化合物，具有多种生物活性和很高的药用价值，也是人类饮食中最主要的生物类黄酮。近几年，槲皮素的性能引起国内外学者的广泛关注，并对其生物活性、药理作用都进行了大量的研究。槲皮素具有扩张冠状动脉、降低毛细血管通透性和脆性、抗病毒、抗炎、抗肿瘤、抗纤维化、抗血小板聚集、抗过敏、镇痛、抗氧化、清除自由基等多种药理作用［1］。我们用小鼠Lewis肺癌以及乳腺癌实验，研究了槲皮素对肿瘤转移的抑制作用以及对机体免疫功能的影响。

1 实验材料

1.1 主要试剂

无水乙醇（分析纯，天津市德思化学试剂有限公司，20061027）；Tween80（分析纯，天津市红岩化学试剂厂，20060824）；二甲基亚砜（DMSO，分析纯，天津市大茂化学试剂厂，20060702）；丙酮（分析纯，天津市科密欧化学试剂开发中心，2004111）1；槲皮素（纯度98%，陕西荟科天然产物有限公司提供，临用前制成注射用溶液）。

1.2 实验动物及瘤株

C57BL／6、BALB／c小鼠，雌性，6～8 周，18～22g，北京维通利华实验动物有限公司提供；C57BL／6小鼠Lewis肺癌瘤株、BALB／c小鼠4T1乳腺癌瘤株均购于上海细胞所；本实验室C57BL／6、BABL／c小鼠自身传代保存的实体瘤。

1.3 实验仪器

洁净工作台（100级洁净等级，上海博迅实业有限公司医疗设备厂）；快速混匀器（SK－1，常州国华电器有限公司）；不锈钢手提式灭菌器（DSX－280A，上海市申安医疗器械厂）；台式离心机（TDL－50B，上海安亭科学仪器厂）；电子天平（FA1004N，上海精密科学仪器有限公司）；移液器20～200 μL、100～1000μL（法国吉尔森公司）。

2 方法

2.1 对小鼠Lewis肺癌术后肺转移的影响

将在体小鼠Lewis肺癌实体瘤组织用组织匀浆器制备单细胞悬液，调细胞数1×106个／mL。0.2mL／只接种于20只C57BL／6小鼠右足趾皮下，接种次日开始腹腔注射给药。对照组给予空白溶剂（10 mL／kg）；槲皮素实验治疗组用槲皮素（10mg／kg）注射，每组10只小鼠。待肿瘤长至直径约5mm 时截去荷瘤全足，继续治疗3周，处死小鼠，切除肺脏，称重，观察肿瘤肺转移结节和免疫器官脏器指数。肺转移结节计数方法：将称重后的肺脏按其原始5 叶切开，以体积分数10%的甲醛溶液固定24h，再用生理盐水冲洗，计数各组肉眼可见肺癌转移结节总数。

2.2 对小鼠4T1乳腺癌术后肺转移的影响［2－3］

将在体小鼠4T1乳腺癌实体瘤组织用组织匀浆器制备单细胞悬液，调细胞数1×106个／mL。0.2mL／只接种于20 只BALB／c小鼠右足趾皮下，接种次日开始腹腔注射给药。对照组给予空白溶剂（10mL／kg）；槲皮素实验治疗组用槲皮素（10mg／kg）注射，每组10只小鼠。待肿瘤长至直径约5mm 时截去荷瘤全足，继续治疗3周，处死小鼠，切除肺脏，称重，观察肿瘤肺转移结节和免疫器官脏器指数。肺转移结节计数方法：将称重后的肺脏按其原始5 叶切开，以体积分数10%的甲醛溶液固定24h，再用生理盐水冲洗，计数各组肉眼可见肺癌转移结节总数。

2.3 对荷瘤小鼠免疫功能的影响［4－5］

按前述方法制备4T1 乳腺癌肿瘤细胞，将肿瘤细胞接种于小鼠后肢皮下，次日开始给药，剂量同前，连续3周。肿瘤长出后，用排水容积法每周测量肿瘤体积2次。治疗结束次日，将小鼠处死，切除肿瘤、脾脏、淋巴结，称重。脾脏指数＝脾脏质量（mg）／体质量（g）。

2.4 统计学方法

3 结果

3.1 对小鼠Lewis肺癌及4T1乳腺癌术后肺转移的影响

槲皮素对小鼠lewis肺癌及4T1乳腺癌术后肺转移有抑制作用，能明显减少肿瘤结节数，对转移后的肿瘤生长也有明显的抑制作用（见表1、图1、图2）。

表1 槲皮素对小鼠Lewis肺癌及4T1乳腺癌术后肺转移的影响（，n＝10）

3.2 槲皮素对荷瘤小鼠免疫功能的影响

槲皮素对4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾脏指数有明显降低作用，可以使淋巴结缩小，使皮下肿瘤生长减缓，分别见表2、图3、图4。

表2 槲皮素对4T1乳腺癌荷瘤小鼠脾脏指数和肿瘤大小的影响（，n＝10）

图1 槲皮素对Lewis肺癌术后肺转移的影响

图2 槲皮素对4T1乳腺癌术后肺转移的影响

图3 槲皮素对4T1乳腺癌荷瘤小鼠淋巴结大小的影响

图4 槲皮素对4T1皮下肿瘤生长的影响

4 讨论

化疗药物毒性大、对肿瘤细胞选择性差，尤其是对机体免疫系统的破坏，容易导致肿瘤的复发。如果药物既能直接杀伤肿瘤细胞，又能增强机体自身免疫，对治疗肿瘤无疑非常有利。一些小分子天然产物，因独特的作用机制及对机体无毒情况下的抗肿瘤作用，备受人们关注。

近年来研究［6－10］表明，槲皮素在抗肿瘤转移方面显示出明显功效。其作用机制可能为：①对细胞周期的作用。槲皮素在肺癌细胞中可下调变异的p53 蛋白，使它的表达达到一个几乎不可检测的水平，且浓度越低，下调作用越弱。p53表达的抑制使得细胞停滞于G2－M 期。槲皮素抑制了HL260 细胞的增殖，可逆地增加了G2／M 期的细胞数，减少了G0／G1 期的细胞数，并具有剂量依赖性。槲皮素可减少DNA的复制，导致细胞分裂的延迟。②促进细胞凋亡。槲皮素显著抑制抗凋亡蛋白Bcl－2的表达，槲皮素封闭表皮生长因子受体酪氨酸蛋白激酶活性，抑制胰腺癌细胞系MiaPaCa－2的生长，导致其凋亡。槲皮素抗增殖作用至少部分是由于调节了EGF 介导的信号通路，PTK 抑制剂阻止了EGFR 信号通过，从而诱导了细胞凋亡。

在试验中，槲皮素能阻止Lewis肺癌和乳腺癌的转移，证实了其在机体整体系统中的抗肿瘤转移作用，作用机制可能主要与上述的促进细胞凋亡和阻止细胞周期相关。

我们的研究表明，槲皮素不仅对肿瘤有良好的转移抑制作用，并且可以促进免疫系统发生反应，分化更多免疫细胞以对抗癌细胞。槲皮素较之常规化疗药物有其优势，将其用于不能耐受常规肿瘤化疗的患者或者经结构改造后使其抗肿瘤及免疫调节作用均增强，这不失为一种可行的研制抗肿瘤药物的新途径。槲皮素在我国资源十分丰富，药理作用广泛，抗肿瘤作用也颇有希望，加强槲皮素的基础和临床研究，进一步开发这个植物中普遍存在的有效成分，使之成为防治癌肿的制剂。

［1］王艳芳，王新华，朱宇同.槲皮素药理作用研究进展［J］.天然产物研究与开发，2003，15（2）：171－173.

［2］于丽娟，林海红，杜钢军，等.灯盏花素对小鼠乳腺癌术后转移和复发的预防作用［J］.河南大学学报：医学版，2009，28（3）：182－184.

［3］杜钢军，林海红，杨义明，等.托盘根乙醇提取物的抗肿瘤抗转移作用研究［J］.中国现代应用药学杂志，2002，19（5）：368－369.

［4］李佳桓，林海红，杜钢军.巴豆不同给药方式对荷瘤小鼠的影响［J］.河南大学学报：医学版，2012，31（1）：8－11.

［5］叶会呈，文慧玲.槲皮素对小鼠免疫功能影响研究［J］.中国医药导刊，2008，10（4）：611－613.

［6］朱蕾，何丽娅.槲皮素抗癌作用的分子机制［J］.武汉科技大学学报：自然科学版，2004，27（2）：194－196.

［7］孟德胜，汪仕良.槲皮素的抗癌作用［J］.中草药，2001，32（2）：187－188.

［8］Yoshida M，Yamamoto M，Nikaido T.Quercetin arrests human leukemic T－cells in late G1phase of the cell Cy cle［J］.Cancer Res，1992，52（23）：6676－6681.

［9］Lee L T，Huang Y T，Hwang J J，et al.Blockade of the epidermal growth factor receptor tyrosine kinase activi2ty by quercetin and luteolin leads to growth inhibition and apoptosis of pancreatic tumor cells［J］.Anticancer Res，2002，22（3）：1615－1627.

［10］Zhang X，Xu Q，Saiki I.Quercetin inhibits the invasion and mobility of murine melanoma B162BL6cells through inducing apoptosis via decreasing Bcl22expression［J］.Clin Exp Metastasis，2000，18（5）：415－421.