大豆异黄酮对D-半乳糖所致衰老大鼠的影响

顾饶胜，范红艳，王艳春，沈 楠，常 影，任 旷* (吉林医药学院:.药理教研室，.实验中心机能实验室，吉林 吉林 303)

大豆异黄酮(soybean isoflavone，SI)是一种在结构和功能上与雌二醇非常相似的植物雌激素，主要分布于大豆种子的子叶和胚轴中，种皮中含量极少。随着大豆制品的普及和摄入量的逐渐增加，加之近年来表现的广泛的生物学活性，如促生长、增强机体免疫、抗氧化、抗肿瘤、神经保护、防治心血管疾病等作用，大豆异黄酮日益受到关注［1-4］。本研究采用D-半乳糖(D-galactose，D-gal)建立体内大鼠衰老模型，观察不同剂量SI对大鼠衰老的影响，并探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 动物及药品试剂

Wistar大鼠，清洁级，雌雄兼用，由吉林大学基础医学部动物实验中心提供。

大豆异黄酮，郑州荔诺生物科技有限公司，纯度99%;D-gal，张家港市华昌药业有限公司;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒、ATP试剂盒和总蛋白试剂盒，南京建成生物工程公司。

1.2 实验分组和给药

Wistar大鼠60只，体重180～220 g，随机分为5组:正常组、模型组(D-gal组)、SI各剂量组［100、200、400 mg/(kg·d)］，每组12只。除正常组，各组均颈背部皮下注射D-gal120 mg/(kg·d)，连续6周，SI组自第2天开始灌胃给药6周，每日1次，正常组和模型组每日给予相同体积的0.25%羧甲基纤维素钠溶液。

1.3 学习记忆能力的测定

于给药结束后次日进行Morris水迷宫行为测试。水迷宫为直径150 cm，高60 cm，水深30 cm，水温(22±1)℃，加适量二氧化钛使水呈乳白色。将平台放在西南象限正中距池壁22 cm处，迷宫中液面高于平台1 cm，训练期间环境安静，迷宫外参照物不变。每天上午8:00-10:00，每组分别训练1次，连续训练4 d。大鼠头部涂以黄色染剂，训练时每天从东侧入水点将大鼠面向池壁放入水池，同时启动记录装置，记录大鼠寻找平台的时间(逃避潜伏期，escape latency)，设定120 s为最长逃避潜伏期，120 s后自动停止记录。若大鼠在120 s内仍未找到平台，则将其引至平台并停留10 s，潜伏期记为120 s。于第5天行定位航行实验和空间探索实验。

定位航行试验:将大鼠于西南象限面向池壁放入水中，自动记录大鼠找到平台的潜伏期，检测大鼠的学习能力。

空间探索实验:定位航行试验结束后撤除平台，选择西南象限的中心作为入水点，将大鼠面向池壁放入水中，观察并记录120 s内大鼠在原平台所在象限的停留时间(有效区停留时间)以及穿越原平台次数，以检验大鼠的记忆能力。

1.4 标本的收集

Morris水迷宫实验结束后禁食不禁水12 h，称量体重，以10%的水合氯醛腹腔注射麻醉，腹主动脉取血，静置30 min，3 000 r/min，离心15 min，分离得血清备用;迅速在冰上取脑组织，用4℃生理盐水洗涤脑组织，吸干，精确称量0.2 g，加2 mL生理盐水，在冰浴下制成10%组织匀浆，3 000 r/min，离心15 min，取上清液备用。迅速取出胸腺、脾，吸去血液，修去脂肪、系膜，并立即用电子天平称取湿重，计算胸腺指数、脾指数。指数计算采用如下公式:

1.5 血清中MDA含量、SOD活性的测定

取血清严格按试剂盒说明测定MDA含量;取血清严格按SOD试剂盒说明测定其活性。

1.6 脑组织Na+-K+-ATP酶活性的测定

取10%脑组织匀浆的离心上清液，严格按ATP酶试剂盒说明测定其Na+-K+-ATP酶活性。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 SI对D-gal致衰老大鼠学习记忆能力的影响

结果表明，模型组大鼠学习记忆功能障碍、空间定位记忆障碍，表现为模型组的逃避潜伏期较正常组明显延长、有效区停留时间减少，差异有统计学意义(P＜0.01)。SI中、高剂量［200，400 mg/(kg·d)］组与模型组比较，其逃避潜伏期显著缩短、有效区停留时间增加(P＜0.05或P＜0.001)，表明SI可以改善衰老大鼠的学习记忆能力，但尚未达到正常组水平，见表1。

2.2 SI对D-gal致衰老大鼠胸腺指数和脾指数的影响

结果显示，与正常组比较，模型组胸腺指数和脾指数降低(P＜0.05)，SI中、高剂量［200，400 mg/(kg·d)］组大鼠胸腺指数和脾指数增加，与模型组比较具有统计学差异(P＜0.05)。结果表明，经Dgal造模后，大鼠脾指数、胸腺指数降低，而大豆异黄酮能显著改善这种变化，说明大豆异黄酮能拮抗Dgal造模后大鼠脾和胸腺功能的衰退，提高免疫力，见表2。

表1 SI对D-gal致衰老大鼠学习记忆能力的影响(±S，s，n=12)

表1 SI对D-gal致衰老大鼠学习记忆能力的影响(±S，s，n=12)

与对照组相比:#P＜0.05，##P＜0.01;与模型组相比:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组别 逃避潜伏期 有效区停留时间对照组26±18 5.2±2.1模型组 55±41## 2.1±0.9##SI 100 mg/(kg·d) 50±40 2.7±1.8 SI 200 mg/(kg·d) 35±27* 4.1±2.4*SI 400 mg/(kg·d) 30±28＊＊ 5.0±2.3＊＊

表2 SI对D-gal致衰老大鼠胸腺指数和脾指数的影响(±S，mg/g，n=12)

表2 SI对D-gal致衰老大鼠胸腺指数和脾指数的影响(±S，mg/g，n=12)

与对照组相比:#P＜0.05;与模型组相比:*P＜0.05

组 别TW/BW SW/BW对照组2.0±0.7 2.4±0.4模型组 1.5±0.4# 2.0±0.5#SI 100 mg/(kg·d) 1.8±0.4 2.1±0.2 SI 200 mg/(kg·d) 1.8±0.4* 2.2±0.3*SI 400 mg/(kg·d) 1.9±0.5* 2.3±0.2*

2.3 SI对D-gal致衰老大鼠血清中MDA含量、SOD活性的影响

结果表明，模型组大鼠血清中MDA含量明显高于正常组、SOD活性明显低于正常组(P＜0.01)。SI中、高剂量组大鼠血清中MDA含量减少，SI中、高剂量组大鼠血清中SOD活性增强，与模型组比较具有统计学差异(P＜0.05或P＜0.01)，见表3。

表3 SI对D-gal致衰老大鼠血清中MDA含量、SOD活性的影响(±S，n=12)

表3 SI对D-gal致衰老大鼠血清中MDA含量、SOD活性的影响(±S，n=12)

与对照组相比:#P＜0.05，P##＜0.01;与模型组相比:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 MDA(nmol/ml) SOD(U/ml)7.6±1.3 143±7模型组 12.1±2.3## 122±16##SI 100 mg/(kg·d) 10.2±2.6 124±25 SI 200 mg/(kg·d) 8.6±4.1* 134±10*SI 400 mg/(kg·d) 7.6±1.6＊＊ 140±24对照组*

2.4 SI对D-gal致衰老大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶活性的影响

结果表明，模型组大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶活性明显低于正常组(P＜0.05)。SI中、高剂量［200，400 mg/(kg·d)］组大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶的活性明显高于模型组，具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，说明SI具有一定的提高Na+-K+-ATP酶活性的作用，见表4。

表4 SI对D-gal致衰老大鼠脑组织Na+-K+-ATP酶活性的影响(±S，n=12)

表4 SI对D-gal致衰老大鼠脑组织Na+-K+-ATP酶活性的影响(±S，n=12)

与对照组相比:#P＜0.05;与模型组相比:*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 Na+-K-ATPase［μmolPi/(mgprot·hour )］对照组0.30±0.14模型组 0.20±0.05#SI 100 mg/(kg·d) 0.20±0.08 SI 200 mg/(kg·d) 0.29±0.11*SI 400 mg/(kg·d) 0.31±0.07＊＊

3 讨论

衰老是机体各种生化反应的综合表现，是机体内外众多因素(遗传、精神、环境污染等)共同作用的结果。目前关于衰老发生机制的学说有遗传程序学说、免疫系统退化学说、氧自由基学说、代谢学说等。端粒及端粒酶的发现［5］使遗传程序学说有了新进展。端粒是真核细胞染色体末端的重复DNA序列，对染色体末端起保护作用，并决定细胞的复制与衰老。DNA每复制1次，端粒即丢失50～200 bP，当它缩短到一定程度时，细胞则停止分裂、衰老、死亡。端粒序列的复制依赖于一种特殊的DNA聚合酶，即端粒酶，目前国内外有大量的研究报道实验动物或人类组织细胞在衰老过程中端粒酶活性的变化，但对影响端粒酶活性的因素研究较少。免疫系统退化学说认为，在衰老过程中，老年机体的免疫功能低下/紊乱是机体衰老的主要原因之一。随着年龄的增长，机体在衰老过程中免疫器官-胸腺萎缩，60岁左右萎缩至最小。胸腺能够产生胸腺细胞，并分化成T细胞和多种亚型，胸腺细胞可以分泌胸腺素;衰老时胸腺上皮细胞分子表达下降导致胸腺组织产生T细胞的能力及淋巴细胞产生成熟的细胞因子能力明显下降，免疫功能随之下降。同时，脾脏是人类最大的外周免疫器官，是B淋巴细胞、T淋巴细胞的主要居所，也是免疫反应的主要场所，脾脏功能的衰退同样可引起B淋巴细胞、T淋巴细胞功能的减退［6］。自由基学说认为，自由基过多可攻击生物膜中的多不饱和脂肪酸，引发脂质过氧化作用，生成脂质过氧化物，损害生物膜，自由基还使DNA、RNA、蛋白质变性，导致细胞正常生理活动受损引起衰老。

衰老模型的建立是研究衰老的前提，也是研究衰老的表现、机理以及筛选延缓衰老药物的主要手段，寻找并研究一种经济有效的抗衰老药物成为当前医学研究的紧迫课题。目前常用的动物模型有臭氧致衰老小鼠模型，D-gal致大鼠、小鼠亚急性衰老模型，辐射致小鼠亚急性衰老模型［7］，环磷酰胺或肾上腺皮质激素致免疫功能低下小鼠衰老模型，用醋酸泼尼松致肾虚衰老小鼠模型等。最常见的致衰老模型是采用D-gal注射法，其机理主要是过量的D-gal在醛糖还原酶催化下还原成半乳糖醇，后者不能被进一步代谢而堆积在细胞内，影响正常渗透压，导致细胞肿胀、功能障碍、代谢紊乱、破坏并消耗机体抗氧化防御系统，使自由基积聚、而过氧化脂质等增高出现衰老［8］。机体衰老的基础是细胞衰老，而细胞水平的改变主要表现在细胞膜上。Na+-K+-ATP酶是细胞膜上重要的膜蛋白，其活性改变是反映机体早期生理功能衰退极为敏感的指标，现已作为观察衰老的新指标［9］。本研究体内实验结果表明，模型组大鼠脑组织中Na+-K+-ATP酶活性降低，且出现明显的学习记忆障碍、免疫器官衰退，表现为逃避潜伏期明显延长，有效期停留时间明显减少，胸腺指数、脾指数降低，与正常组比较具有统计学意义，表明衰老模型复制成功。经SI治疗6周后，SI中、高剂量［200，400 mg/(kg·d)］组大鼠脑组织中N+-K+-ATP酶活性增强，逃避潜伏期明显缩短，穿越平台次数明显增加，胸腺指数、脾指数增高，与模型组比较，具有统计学意义(P＜0.05或P＜0.01)，说明SI通过稳定细胞膜，保护细胞免受损伤，而减弱了D-gal导致的衰老作用，使免疫器官的衰退减弱，使大鼠的学习记忆能力提高。

MDA是自由基对不饱和脂肪酸引发的脂质过氧化物的最终产物，MDA水平高低间接反映细胞受自由基攻击的严重程度。SOD是体内重要的抗氧化酶，SOD活性间接反映机体清除氧自由基的能力。二者含量的测定被公认是抗衰老药物研究的重要指标。本研究体内实验结果表明，模型组大鼠血清中MDA含量增高、SOD活性降低与正常组比较具有统计学意义，再次说明衰老与自由基作用密切相关。本研究体内实验采用SI灌胃6周，在100～400 mg/(kg·d)剂量范围内可见衰老大鼠学习记忆能力的提高，同时大鼠血清中MDA含量减少、SOD活性增强。结果表明:SI的改善学习记忆作用可能与其提高机体SOD等抗氧化酶活力，降低MDA等代谢产物的产生，增强其对自由基的清除能力，抑制脂质过氧化作用，保护脑神经细胞免受自由基的损害有关。

大豆异黄酮为杂环多酚类化合物，为非甾体类激素，其主要成分是三羟异黄酮、二羟异黄酮和6-甲氧基大豆素。它们的结构与17B-雌二醇相似，可与ER结合，表现弱雌激素作用。本研究结果显示SI作为一种植物雌激素［10］，它的抗衰老作用与稳定细胞膜、抗氧化如清除过氧化氢、过氧化物阴离子和羟自由基有关。

［1］ Mao Zhen，Zheng Yuanlin，Zhang Yanqiu，et al.The antiapoptosis effects of daidzein in the brain of D-galactose treated mice［J］.Molecules，2007，12(7):1455-1470.

［2］ 钱 进，毛 缜，杨 敏，等.大豆异黄酮改善衰老小鼠肾脏抗氧化作用的研究［J］.徐州师范大学学报:自然科学版，2008，26(1):52-55.

［3］ 毕建忠，王 萍，王世军，等.大豆异黄酮对Alzheimer病大鼠认知功能及海马NR2B表达的影响［J］.临床神经病学杂志，2005，18(6):432-435.

［4］ 周 俐，刘建新，周 青，等.大豆异黄酮对大鼠心肌肥厚与纤维化的保护作用［J］.中草药，2007，38(11):1673-1676.

［5］ 吕欣桐.端粒、端粒酶与抗衰老的研究进展［J］.医学信息，2011，24(5):2857-2858.

［6］ Salvioli S，Capri M，Scarcella E，et al.Age-dependent changes in the susceptibility to apoptosis of peripheral blood CD4+and CD8+Tlymphocytes with virgin or memory phenotype［J］.Mech Aging Dev，2003，124(4):409-418.

［7］ 杨薛康，海春旭，梁 欣，等.辐射致急性小鼠衰老模型的建立［J］.癌变·畸变·突变，2007，17(6):491-493.

［8］ Wei Haifeng，Li Lin，Song Qiujie，et al.Behavioural study of the D-galactose induced aging model in C57BL/6J mice［J］.Behav Brain Res，2005，157(2):245-251.

［9］ 李笑萍，喻培先，赵 冬.D-半乳糖衰老模型观察的新指标［J］.中国现代应用药学杂志，2004，21(6):442-444.

［10］ Glazier M G，Bowman M A.A review of the evidence for the use of phytoestrogens as a replacement for traditional estrogen replacement therapy［J］.Arch Intern Med，2001，161(9):1161-1172.