LCQG对MRL/lpr狼疮鼠抗ds-DNA抗体、IgG、IgA水平的影响①

梁 涛 瞿凌晨 梁 卫 吕高虹 许 立 (南京中医药大学药理教研室，南京 210023)

系统性红斑狼疮(SLE)是一个累及肾、肝、心等脏器，临床表现复杂，病程迁延反复的自身免疫性疾病，该病会导致免疫紊乱，从而导致自身抗体产生、免疫复合物形成和补体活化。西医多采用肾上腺皮质激素和免疫抑制剂治疗本病，但由于SLE本身的复杂性以及上述药物长期使用的严重副作用，故寻找安全有效、副作用小的治疗药物仍为当务之急。中医药对SLE的治疗效果已得到国内外学者的充分肯定，具有改善和调节免疫功能，毒副作用小，可长期给药等优点。本文研究的狼疮清颗粒是从《备急千金要方》所载的犀角地黄汤中而来，是在名老中医周仲英教授指导下对犀角地黄汤进行加减而成，具有清热解毒、凉血化瘀、滋养阴液功效。我们对其进行了主要药效学研究，观察其对二甲苯所致ICR小鼠耳肿胀、MRL/lpr自发性红斑狼疮小鼠尿蛋白、血清抗ds-DNA抗体、IgG水平、肾组织中免疫球蛋白IgG、IgA沉积的影响进行研究，为今后开发新药奠定基础。

1 材料与方法

1．1 动物 ICR小鼠，18～22克，雄性，南通大学实验动物中心，合格证号:SCXK(苏)2008-0010;MRL/lpr狼疮鼠:雌性，8周龄，中国人民解放军军事医学科学院实验动物中心提供，许可证号:SCXK-(军)2007-004。

1．2 药品与试剂 狼疮清颗粒(LCQG):南京中医药大学提供，药物主要组成:水牛角片12 g，生地12 g，白花蛇舌草20 g，漏芦10 g，炙僵蚕10 g，秦艽10 g，丹皮 10 g、赤芍 12 g，陈皮 6 g，制黄精 10 g，炒白术10 g等;批号100510，100726。阿司匹林(Aspirin):阿斯特拉制药有限公司，批号:20100121;泼尼松(Prednisone):天津药业公司，批号:100309。dsDNA检测试剂盒和IgG检测试剂盒:由上海蓝基生物有限公司提供;尿蛋白试剂盒:由南京建成生物有限公司提供;DAPI染色试剂盒、FITC-羊抗小鼠IgG抗体:南京凯基生物科技发展有限公司提供;FITC-羊抗小鼠IgA抗体:SANTA CRUZ，货号:sc-3692;二甲苯、甲醇、乙醇、枸橼酸三钠等其它试剂:均为国产分析纯。

1．3 仪器 荧光倒置显微镜OLYMPUS;耐高温塑料染色架:福州迈新;FA1004电子天平;上海天平厂;切片机:美国 Reichert HistoSTAT;孵箱:上海精宏实验设备有限公司;烤箱:上海圣欣科学仪器有限公司101AS-3;SyneRgy HT酶标仪:美国Bio-Tek。

1．4 二甲苯所致ICR小鼠耳肿胀的造模、分组及给药 ICR雄性小鼠50只，体重18～22 g，按体重随机分为5组，每组10只。(1)模型组:给予等体积的蒸馏水;(2)阿司匹林组(Aspirin):0．6 g/kg;(3)LCQG小剂量组:11．4 g/kg;(4)LCQG中剂量组:22．8 g/kg;(5)LCQG 大剂量组:45．6 g/kg;给药体积10 ml/kg，LCQG各剂量组当天灌胃给药3天，末次给药45分钟后，于小鼠右耳两面涂二甲苯0.05 ml/只致肿，左耳不涂为正常耳。

1．5 肿胀抑制率的计算 45分钟后脱颈椎处死小鼠，用9 mm打孔分别在左右耳相同部位打下圆片，电子天平称耳片重，肿胀度=每鼠右耳重量-左耳重量。肿胀抑制率(%)=(模型组平均肿胀度－给药组平均肿胀度)/模型组平均肿胀度×100%。

1．6 MRL/lpr狼疮鼠的分组及给药 取MRL/lpr小鼠32只，雌性，8周龄，饲养至90日龄，随机分成4组，每组8只，模型组:MRL/lpr小鼠给予蒸馏水;中药治疗组 ig LCQG 45．6g/(kg·d);西药组:ig prednisone 10 mg/(kg·d);中药组+西药治疗组 ig LCQG 45．6 g/(kg·d)+prednisone 10 mg/(kg·d)，给药体积0．1 ml/10 g，连续给药6周，于第6周末进行以下各项指标检测。

1．6．1 血清ds-DNA抗体、IgG和尿蛋白测定 小鼠摘除眼球取血，离心取血清，采用ELISA法测定血清ds-DNA抗体、IgG含量，参考说明书步骤操作，于450nm处检测吸光度值，根据标准曲线计算样品中ds-DNA抗体、IgG含量;小鼠代谢笼收集24小时尿液，考马斯亮蓝法检测尿蛋白定量。

1．6．2 肾脏荧光免疫组化IgG、IgA的检测 小鼠脱臼处死，迅速取出肾脏并固定。脱蜡:按常规方法进行脱蜡及水合(例:二甲苯脱蜡2次，5 min/次;乙醇水合(100%、95%、90%、80%、70%)。PBS浸泡5分钟，洗涤3次。微波修复:将切片置于枸橼酸三钠∶枸橼酸=3∶4配成的溶液中，微波中高火8分钟。冷却后，PBS浸泡5分钟，洗涤3次。封闭灭活酶:3%H2O2-甲醇溶液处理切片15分钟。PBS浸泡5分钟，洗涤3次。加荧光标记二抗:FITC-羊抗小鼠 IgA(1∶500)100 μl，FITC-羊抗小鼠 IgG(1∶200)100μl，37℃，孵育1小时。PBS浸泡5分钟，洗涤3次。DAPI染色:甲醇∶DAPI原液 =19∶1，配成 DAPI染液工作液，加100μl，室温避光10分钟。PBS浸泡5分钟，洗涤3次。封片:用防荧光淬灭的封片剂封片。荧光显微镜观察拍照进行免疫荧光检测(绿色荧光为细胞内FITC的阳性标记;蓝色为DAPI染色的细胞核结构)。

1．7 统计学分析 采用SPSS15．0统计软件分析。计量资料用±s表示，组间比较采用 F检验及Dunnett-t检验进行统计学处理。

2 结果

2．1 对二甲苯所致小鼠耳肿胀实验 阿司匹林和LCQG大剂量组可对抗二甲苯所致小鼠耳肿胀，与模型组比较有显著性差异(P＜0．05)，说明LCQG对二甲苯所致耳肿胀有一定抗炎作用。见表1。

2．2 对MRL/lpr狼疮鼠尿蛋白、IgG、ds-DNA抗体的影响 中药组(LCQG)、西药组(Predinisone)、中药+西药组(LCQG+Predinisone)的血清抗dsDNA抗体、IgG和尿蛋白水平均显著低于模型组(P＜0.05)，其中LCQG+Predinisone的血清IgG和抗ds-DNA抗体水平低于中药组。见表2。

表1 LCQG对二甲苯致ICR小鼠耳肿胀的抗炎作用(n=10，±s)Tab．1 Effect of anti-inflammatory on ear-swelling inducedby xylene in ICR mice(n=10，±s)

表1 LCQG对二甲苯致ICR小鼠耳肿胀的抗炎作用(n=10，±s)Tab．1 Effect of anti-inflammatory on ear-swelling inducedby xylene in ICR mice(n=10，±s)

Note:Compared with model group，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01．

Groups Dose(g/kg)Ear-swelling(mg)Inhibitory rate(%)----32．98 19．15 26．60 27．13 Model Aspirin LCQG(L)LCQG(M)LCQG(H)--0．6 11．4 22．8 45．6 0．018 8 ±0．005 8 0．012 6 ±0．003 62)0．015 2 ±0．004 2 0．013 8 ±0．005 2 0．013 7 ±0．003 51)

表2 LCQG对MRL/lpr狼疮鼠血清IgG、dsDNA抗体水平及尿蛋白含量的影响(n=8，±s)Tab．2 Influence of LCQG in serum content of IgG anti-dsDNA antibody and urinary protein in MRL/lpr lupusmice(n=8，±s)

表2 LCQG对MRL/lpr狼疮鼠血清IgG、dsDNA抗体水平及尿蛋白含量的影响(n=8，±s)Tab．2 Influence of LCQG in serum content of IgG anti-dsDNA antibody and urinary protein in MRL/lpr lupusmice(n=8，±s)

Note:Compared with model group，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01．

Groups Dose(g/kg) IgG(μg/ml) anti-dsDNA antibody(pg/ml) Urinary protein(μg/ml)937．8 ±80．55 LCQG 45．6 20．05 ±2．751) 325．14 ±41．321) 677．6 ±167．921)Predinisone 0．01 19．34 ±3．231) 290．47 ±44．541) 629．2 ±173．061)LCQG+Predinisone 45．6+0．01 16．74 ±2．351) 285．07 ±31．082) 607．6 ±85．852)Model — 33．80 ±9．62 468．24 ±87．521)

图1 LCQG对狼疮鼠肾组织IgG沉积的影响(IF，×400)Fig．1 Influence of deposition of IgG in renal tissue in lupusmice(IF，×400)

图2 LCQG对狼疮鼠肾组织IgA沉积的影响(IF，×400)Fig．2 Influence of deposition of IgA in renal tissue in lupusmice(IF，×400)

表3 肾组织免疫荧光IgA、IgG检测结果±s)Tab．3 Detection results of IgG and IgA in renal tissue by immunofluoresscence±s)

表3 肾组织免疫荧光IgA、IgG检测结果±s)Tab．3 Detection results of IgG and IgA in renal tissue by immunofluoresscence±s)

Note:Compared with model group，1)P ＜0．05，2)P ＜0．01．

Groups Dose(g/kg)Percentage of IgA positive area(%)Percentage of IgG positive area(%)47．98 ±4．896 42．70 ±8．291 LCQG 45．6 34．62 ±5．9051) 27．88 ±2．7291)Predinisone 0．01 31．21 ±6．0231) 25．63 ±4．5261)LCQG+Predinisone 45．6+0．01 25．64 ±7．2862) 23．61 ±3．2292)Model —

2．3 对狼疮性MRL/lpr小鼠肾脏荧光免疫组化的影响 荧光显微镜下可见，模型组 IgG、IgA均呈强阳性，荧光阳性面积范围较大。中药组(LCQG)、西药组(Predinisone)IgG、IgA荧光强度较弱，荧光阳性面积显著减少(P ＜0．05)，中药 +西药(LCQG+Predinisone)组荧光强度呈微弱阳性，IgG、IgA荧光面积显著减少(P ＜0．01)。见图1、2，表3。

3 讨论

SLE的发病原因目前尚不完全清楚，临床以广泛组织和多器官损伤及病情进行性加重为主要特点，预后较差，有约10%的患者在发病5年内死亡［1，2］。其发病机理一般认为:由于机体免疫系统中主要的调节性及效应性细胞出现功能异常，即T淋巴细胞亚群比例，体内Th1/Th2细胞之间比例失衡，自身反应性T细胞增殖，导致B细胞功能亢进产生大量自身抗体，体内抗原和抗体结合形成免疫复合物沉积于脏器，损伤细胞膜，从而出现SLE的各种临床症状［3-5］。SLE是迄今为止发现的最为典型的自身免疫性疾病。

SLE的治疗原则为消除炎症的抗炎疗法和纠正病理过程。本研究的结果显示:狼疮清颗粒可以抑制二甲苯导致的小鼠耳肿胀，抗炎作用明确，同时由于SLE患者体内存在着免疫功能的紊乱，大量自身抗体的产生，血清中免疫球蛋白含量的明显升高。本实验选用MRL/lpr狼疮鼠作为动物模型，此鼠由LG/J、AKR/J、C3H/D 及 C57BL/6 等不同品系小鼠交配至第12代时产生，以显著的淋巴腺病、脾肿大、大量抗DNA抗体和肾炎为特征。MRL/lpr的lpr基因被认为是引起SLE的主要基因。这些突变鼠10～12周龄开始出现病理变化，在4个月后同时发生进行性的肾脏损害，系统性血管炎，关节、唾液腺、肺和皮肤的炎症［6，7］。检测 MRL/lpr SLE鼠血清中IgG、抗dsDNA抗体水平，结果发现:模型组IgG、抗dsDNA水平明显较高，中药组、西药组、中药+西药组能降低模型组小鼠血清IgG、抗dsDNA水平，中西药结合治疗效果更明显。抗ds-DNA抗体是SLE的血清学标志物，也是评估病情活动性和预后的重要指标［8，9］。抗ds-DNA抗体等循环抗体特异地结合在核小体或组蛋白上，或者特异地结合在核小体或组蛋白的免疫复合物上，在肾小球基底膜形成新的免疫复合物，引起或加重狼疮性肾炎［10］。蛋白尿是狼疮肾炎的临床特征之一，持续大量蛋白尿是预后差的一个标志，且与肾小球硬化程度相关［11］。结果显示中药、西药组、中西药结合治疗均能降低尿蛋白，中西药结合治疗效果更显著。同时狼疮肾炎的形成主要是由于肾小球系膜及基底膜多种免疫复合物及补体沉积造成的，经肾组织免疫荧光检测时呈阳性，这被认为是狼疮肾炎最有特征性的病理改变［12］。我们的研究表明，中药组、中药+西药组在适宜的剂量下能抑制多种免疫球蛋白(IgG，IgA)在肾脏的沉积，明显改善MRL/lpr SLE小鼠肾组织的病理损害，故中西药结合治疗效果更好。

方中水牛角为君药，具有清热解毒、凉血的作用。臣药白花蛇舌草加强其清热解毒之力;赤芍、丹皮助其凉血散瘀;生地一以清热凉血，一以养阴生津，顾护阴液。佐药炙僵蚕、秦艽、青风藤活血通络止痛，制黄精、炒白术、陈皮具有益气健脾燥湿、理气和胃的功能，以顾护中焦脾胃。本方诸药配伍具有清热解毒、凉血化瘀、滋养阴液、扶正祛邪的功效［13-15］。因而在临床上既能提高西医的治疗效果，又能减少糖皮质激素的用量、副作用、缩短病程。对其如何发挥免疫调节的机制还有待于进一步的研究。

1 M cE lhone K，Abbott J，Teh L S．A review of health related quality of life in systemic lupus erythematosus［J］．Lupus，2006;15(10):633-643．

2 Louis P J，Fernandes R．Review of systemic lupus erythematosus［J］．Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod，2001;91(5):512-516．

3 Ahmed S，Anolik JH．B-cell biology and related therapies in systemic lupus erythematosus［J］．Rheum Dis Clin North Am，2010;36(1):109-130．

4 许德清，曾凡钦主编．红斑狼疮［M］．北京:中国医药科技出版社，2003:79-82．

5 张曲矗，陆进明．系统性红斑狼疮与细胞因子的研究进展［J］．现代生物医学进展，2009;9(19):3794-3796．

6 张 飚，唐福林．系统性红斑狼疮模型鼠MRL/lp研究进展［J］．中华风湿病学杂志，2006;10(2):110-113．

7 任文英，陈扬荣，郑全瑛et al．系统性红斑狼疮小鼠模型的研究近况［J］．免疫学杂志，2003;19(3):91-93．

8 刘京平，林有坤，何 钠．首诊系统性红斑狼疮住院患者ANA、抗ds-DNA与病情活动的研究［J］．中国皮肤性病学杂志，2008;22(1):26-28．

9 洪明玉，叶任高．抗双链DNA抗体与狼疮性肾炎关系的探讨(附776例分析)［J］．中国现代医学杂志，2001;11(2):53-54．

10 Pekvig O P，Nossent JC．Anti-double-stranded DNA antibodies，nucleosomes，and systemic lupus erythematosus［J］．Arthritis Rheum，2003;48(6):300-312．

11 Burton C，Harris K P．The role of proteinuria in the progression of chronic renal failure［J］．Am JKidney Dis，1996;27(6):765-775．

12 邹万忠主编．肾活检病理诊断图鉴别［M］．北京:人民卫生出版社，2000:79-83．

13 周学平，吴勉华，潘裕辉et al．周仲瑛从瘀热辨治系统性红斑狼疮的临证思路与经验［J］．中国中医基础医学杂志，2010;16(3):232-234．

14 梁 涛，邢精红，梁 卫et al．狼疮清颗粒对小鼠免疫功能的影响［J］．中国中医急症，2012;21(1):71-72．

15 梁 涛，瞿凌晨，邢精红 et al．狼疮清颗粒对大鼠Arthus反应的影响［J］．中国中医急症，2011;20(12):1964-1965．