TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4在深静脉血栓患者血白细胞和血小板中的表达

胡继红，赵学凌，李宏昆，吴雪梅，王兵

深静脉血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）指血液在深静脉内异常凝集。随着预防和治疗方法的发展，其发生率已明显下降，但对于严重创伤或大手术后的老年患者，卧床或制动时间较长，下肢静脉血流淤滞，易发生DVT而阻塞静脉，严重者可发生下肢股青肿、缺血坏死，若血栓脱落，可导致大面积肺栓塞（pulmonary embolism，PE）而危及生命，慢性期常伴发DVT后综合征［1］。因此，DVT的早期预测诊断和预防显得非常重要，但对于血栓形成早期，静脉内皮细胞调控、白细胞和血小板功能变化、诱导凝血/抗凝、纤溶/抗纤系统失衡及促进血栓形成的机制尚不完全清楚，目前仍未发现较可靠的预诊标志物［2-3］。本研究拟检测白细胞聚集、血小板活化相关基因转化生长因子（TGF）-β1、纤溶酶原激活物抑制因子1（Serpine1）、血管性血友病因子（vWF）、血小板第4因子（PF4）在DVT患者血液中的表达变化，为探寻预诊标志物提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象与分组

选取下肢静脉曲张患者58例为DVT观察对象，其中10例患者术前发生股静脉血栓者纳入血栓形成组，行抗凝加溶栓规范治疗，待血栓消退，深静脉血流通畅，能保证肢体静脉回流后，再行浅静脉抽剥术，48例术前未发现深静脉血栓者均行浅静脉抽剥术，术后5例发生DVT，亦纳入血栓形成组，故血栓形成组共纳入15例患者。43例未发生DVT者，随机选取15例纳入无血栓形成组。另选15名健康志愿者作为正常对照组。

DVT观察、诊断考虑以下几个方面及要点：由一组高年资医生实施，系统掌握深静脉血栓相关理论；能够准确动态观察症状变化及进行正确的体格检查；掌握相关手术技术，能保证手术质量；结合相应情况及时行超声检查，筛查有无血栓形成；必要时再行静脉造影确诊，确保所采集到的血液样本与相应状态尽可能相符。

1.2 方法

1.2.1 血液样本采集、保存和总RAN的提取确保所采集血液样本与相应状态尽可能相符，按不同组别采血，每例研究对象在相应状态，每次从肘静脉采集静脉血10 ml（真空枸橼酸钠抗凝抽血管，每管约2.7 ml），立即颠倒混匀20次以便充分混匀，避免血液部分凝固、血栓形成。采用血液样本保存试剂盒（PAXgene Blood RNA Tube，BRT，美国QIAGEN公司）保存样本，并于30 min内将血样（2.5 ml）倒入BRT管中，立刻盖上盖颠倒20次充分混匀血样。然后，将BRT管置室温（18～25℃）静置2 h以上（但不超过24 h），以便血样与BRT管中试剂充分反应，达到最佳RNA提取效率。采用血白细胞和血小板中总RNA提取试剂盒（PAXgene Blood RNA Kit，美国QIAGEN公司）提取血白细胞和血小板中总RAN约45μl，具体操作按说明书进行。从每份RNA样本中取5μl按1∶200稀释，检测吸光度260/280（A260/A280）比值均在1.8～2.0。

1.2.2 cDNA合成取8μl RNA模板，加入实时-PCR反应体系，低温（4℃）离心15 s（3 000 g）后放入PCR仪，实时-PCR反应条件为37℃60 min，将RNA反转录为cDNA（Quantscript RT kit Quant cDNA第一链合成试剂盒，天根生化科技公司）。从每份cDNA中取出0.5μl为模板，行PCR扩增内参基因GAPDH，经凝胶电泳检测，条带较亮、大小正确，然后将剩余的cDNA模板（约19μl）置于-80℃储存备用。

1.2.3 PCR和实时-PCR引物设计引物设计采用Primer 5.0软件，要求必须跨越内含子，避免基因组污染，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成（表1）。

表1 人TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4基因引物序列

1.2.4 PCR检 测TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4表达采用PCR试剂盒（2×Taq PCR MasterMix，天根生化科技公司）检测血白细胞和血小板中TGFβ1、Serpine1、vWF、PF4表达。将血液0.5μl cDNA模板，加入RCR反应体系，PCR反应条件为：预变性95℃，3 min；扩增条件：变性95℃30 s，退火60°30 s，72℃，延伸30 s，循环35次；72℃，10 min充分延伸。

1.2.5 实时-PCR检测TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4表达采用荧光实时-PCR试剂盒（Platinum®SYBR®Green qPCR试剂盒，美国Invitrogen公司）检测血白细胞和血小板中TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4表达。采用荧光实时定量PCR仪7300（美国ABI公司）和Power SYBR®Green实时-PCR Master Mix进行实时-PCR，操作按试剂盒说明书进行，设定扩增程序如下：预变性95℃2 min；变性95℃5 s，退火60℃30 s，循环40次。溶解曲线阶段：变性95℃15 s；退火60℃30 s；延伸72℃30 s。以GAPDH作为内参照。TGF-β1等目的基因的相对表达量按公 式2-△△CT=2［CtN（T-gene）-CtN（GAPDH）］-［CtA（T-gene）-CtA（GAPDH）］计算［4］。

1.3 统计学方法

重复检测3次，用SPSS11.5统计学软件进行分析，组间比较采用单因素方差分析（q检验）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCR检测TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在各组中的表达

从凝胶电泳结果可见，血栓形成组中所检测TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 RNA条带灰度值明显较正常对照组及无血栓形成组增高，提示TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4在血栓形成组表达明显增高。

2.2 各组PCR电泳结果A值分析

TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4的A值在血栓形成组中明显高于正常对照组和无血栓形成组，差异有统计学意义（P＜0.05，表2），提示TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4在血栓形成组表达升高。

表2 TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在各组中的表达

2.3 实时-PCR检测TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在各组中的表达

TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4 mRNA在血栓形成组中的表达明显高于无血栓形成组和正常对照组（P＜0.05），后两组间差异无统计学意义（P＞0.05），见表3、4；图2～3）。

表3 TGF-β1和Serpine1在各组间的相对表达量

表4 vWF和PF4在各组间的相对表达量

3 讨论

DVT形成过程是动态变化过程，涉及多系统、多因素，调控机制复杂。参与DVT形成的血管内皮细胞、血白细胞、血小板、粘附因子、炎症因子、血流动力学等因素彼此相互影响，错综复杂，凝血/抗凝、纤溶/抗纤溶系统生理状态下保持动态稳定并相互制约，一旦平衡打破，在分泌的各种细胞因子调控下，内皮细胞、血白细胞、血小板之间相互粘附、聚集，启动凝血级联反应，促使局部分子微环境向血栓形成方向发展，致血栓形成［3］。其中TGF-β1、Serpine1、vWF、PF4对白细胞粘附聚集、血小板活化具有重要调控作用。本研究探讨它们在DVT患者血白细胞和血小板中表达变化及在血栓形成中的作用。

vWF主要在内皮细胞和巨核细胞内合成，在血小板α颗粒、血浆和内皮下连接组织也能产生。vWF能与血小板糖蛋白Ⅰb-Ⅸ和内皮下胶原结合，成为血小板粘附在内皮下的桥梁，桥接血小板与静脉内皮间的粘附；还能与血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa结合，桥接血小板与血小板间的粘附，诱导血小板聚集，参与血栓形成。最近的研究发现，vWF水平增加与动脉粥样硬化、急性冠状动脉综合征、心肌梗死的发生密切相关［5-6］，但在DVT中的研究较少。本研究发现vWF mRNA在DVT患者血白细胞和血小板中表达上调，可能通过诱导血小板粘附、聚集，促进了DVT形成。

血小板α颗粒中25%的蛋白质是PF4，它是血小板活化后释放最多的蛋白，被认为是血小板活化的标志物，活化的血小板可以分泌PF4，并诱导CD40L释放，通过CD40-CD40L结合促进内皮细胞与血小板间的相互粘附，进而介导内皮细胞从静息状态转化为活化状态。PF4可通过上调TLR2表达激活核转录因子（NF）-κB，从而促进内皮细胞表达粘附分子（ICAM-1、E-slectin、VCAM-1）、趋化因子（MCP-1、MIP-1）和炎性因子（TNF、IL-1）促进炎症反应，进而通过趋化因子诱导单核细胞、中性粒细胞募集、粘附于静脉壁内皮，通过E-selectin/ESG-L介导血小板与内皮细胞间的粘附作用，进而促进血栓形成及动脉粥样硬化［7-8］，但在DVT形成中的研究较少。本研究发现PF4 mRNA在DVT患者血白细胞和血小板中表达上调，可能通过介导白细胞粘附和血小板活化，促进了血栓形成。

纤溶系统由纤维蛋白溶解酶（纤溶酶），纤溶酶激活物和纤溶酶抑制物组成。纤溶抑制物包括纤溶酶原激活抑制剂（PAI）、α2抗纤溶酶（α2-AP）和凝血酶激活的纤溶抑制物（TAFI）。Serpine1也称纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1），主要由血管内皮细胞、脂肪细胞、巨噬细胞、心肌细胞、成纤维细胞和肝细胞合成，近来发现血小板也能合成和储存PAI-1，且当血小板活化后可以释放PAI-1，它通过抑制u-PA和t-PA的活性，阻断或减缓纤溶酶原活化为纤溶酶，抑制血栓降解，促进稳定血栓的形成［9］。近来发现，血清PAI-1升高所导致的低纤溶能力，可能是DVT的高危因素之一且Serpine1基因4G/5G的多肽性与DVT发生密切相关［10-11］。前期动物实验发现，DVT模型大鼠股静脉内皮组织中Serpine1表达水平明显上调［12］。本研究发现Serpine1 mRNA在DVT患者血白细胞和血小板中表达明显上调，可能通过抑制纤溶而促进了血栓形成。Serpine1在不同组织中的产生和释放受到多种刺激因素，如内毒素、炎症因子（IL-1等）、TGF-β家族、TNF所调节。

其中，TGF-β家族重要成员TGF-β1可刺激血管平滑肌细胞分泌PAI-1［13］。TGF-β可以通过调控一些相关基因的表达，参与高血压、糖尿病、动脉粥样硬化和心肌肥厚及纤维化等心脑血管疾病的病理进程。但在DVT中的作用研究较少，而本研究发现TGF-β1及其下游基因Serpine1、vWF、PF4 mRNA在DVT患者血白细胞和血小板中表达上调，TGFβ1可能通过调控下游基因Serpine1、vWF、PF4表达，参与白细胞粘附、血小板活化而促进血栓形成。

［1］顾建平，徐克，滕皋军.下肢深静脉血栓形成介入治疗规范的专家共识［J］.介入放射学杂志，2011，20：505-510.

［2］李炯，唐博.静脉血栓栓塞生物标志物的研究进展［J］.重庆医学，2012，41：2326-2328.

［3］Esmon CT.Basic mechanisms and pathogenesis of venous thrombosis［J］.Blood Rev，2009，23：225-229.

［4］Schmittgen TD，Livak KJ.Analyzing real-time PCR data by the comparative C（T）method［J］.Nat Protoc，2008，3：1101-1108.

［5］Xu AG，Xu RM，Lu CQ，et al.Correlation of von willebrand factor gene polymorphism and coronary heart disease［J］.Mol Med Report，2012，6：1107-1110.

［6］van Galen KP，Tuinenburg A，Smeets EM，et al.Von willebrand factor deficiency and atherosclerosis［J］.Blood Rev，2012，26：189-196.

［7］Aidoudi S，Bikfalvi A.Interaction of PF4（CXCL4）with the vasculature：a role in atherosclerosis and angiogenesis［J］.Thromb Haemost，2010，104：941-948.

［8］Kowalska MA，Rauova L，Poncz M.Role of the platelet chemokine platelet factor 4（PF4）in hemostasis and thrombosis［J］.Thromb Res，2010，125：292-296.

［9］Brogren H，Karlsson L，Andersson M，et al.Platelets synthesize large amounts of active plasminogen activator inhibitor 1［J］.Blood，2004，104：3943-3948.

［10］Meltzer ME，Lisman T，de Groot PG，et al.Venous thrombosis risk associated with plasma hypofibrinolysis is explained by elevated plasma levels of TAFI and PAI-1［J］.Blood，2010，116：113-121.

［11］Akhter MS，Biswas A，Ranjan R，et al.Plasminogen activator inhibitor-1（PAI-1）gene 4G/5G promoter polymorphism is seen in higher frequency in the Indian patients with deep vein thrombosis［J］.Clin Appl Thromb Hemost，2010，16：184-188.

［12］胡继红，吴雪梅，李兴国，等.转化生长因子β1和纤溶酶原激活物抑制因子1促进创伤性深静脉血栓形成的实验研究［J］.介入放射学杂志，2011，20：890-894.

［13］Samarakoon R，Higgins SP，Higgins CE，et al.TGF-beta1-induced plasminogen activator inhibitor-1 expression in vascular smooth muscle cells requires pp60（c-src）/EGFR（Y845）and Rho/ROCK signaling［J］.J Mol Cell Cardiol，2008，44：527-538.