单独高胃泌素血症及其与MNNG 合用时对大鼠胃黏膜的影响

李雨文，周丽雅，林三仁，金 珠，邓 凯

北京大学第三医院消化科，北京 100191

胃癌是严重威胁人类健康的消化道恶性肿瘤，其致死率在所有恶性肿瘤中居第2 位，仅次于肺癌［1］。在我国，胃癌每年死亡人数仍位居我国恶性肿瘤的首位，到目前为止，胃癌的发生发展机制尚不清楚，导致治疗效果不尽人意，造成了巨大的社会危害［2］。随着肿瘤分子生物学的不断研究，人们相继发现在胃癌［3］、大肠癌［4］、胰腺癌［5］和小细胞肺癌［6］等肿瘤中均有胃泌素基因的表达，并在相应的细胞膜表面也发现有胃泌素的受体。在癌组织及癌旁组织中胃泌素受体阳性表达率也明显高于正常组织，提示胃泌素可作为肿瘤临床诊断与预后的一项参考指标。Michael等［7］指出胃癌患者血清胃泌素水平明显升高，肿瘤经手术切除后，血清胃泌素明显下降，术后当肿瘤复发时胃泌素水平又再次升高，提示胃泌素的升高可能是胃癌癌前病变的一种征象，可作为鉴别胃良恶性疾病的一个较好的生物学标志物。幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，H.pylori)感染与消化道肿瘤形成的关系正受到人们的重视，Robertson等［8］认为这可能与其诱导的胃泌素水平升高有关。因此，对胃泌素的研究，有助于临床上对患者采取合理的治疗方式。此外，近年来发现，长期使用抑制胃酸分泌药物的患者，胃内pH 值升高，减弱了胃窦部G 细胞的酸抑制作用。于是，G 细胞大量释放胃泌素，使患者产生显著而持久的低酸、高胃泌素血症，胃泌素又通过与其受体结合，引起泌酸黏膜的增生，尤其是引起肠嗜铬样细胞(ECL)的过度增殖［9］。但是，长期使用(5～7年)PPIs的患者中，由于肠嗜铬样细胞的增生而发生胃嗜铬样细胞恶性肿瘤的发生率高于正常人群的报道却很少，这使高胃泌素在胃癌发生中的作用受到了很大的质疑［10］。本研究通过单独的胃泌素刺激及胃泌素与MNNG 合用时对大鼠胃黏膜的影响，来探索胃泌素在诱发胃癌中可能的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 健康雄性Wistar 大鼠24只，体质量70 g 左右，北京维通利华实验动物中心提供［合格证号:SCXK(京)2011-0012］，饲养于北京大学医学部实验动物中心。大鼠安置在含2.5 cm 厚木屑碎片的聚丙烯笼内标准条件下饲养，温度维持在22℃，12 h 光/暗自动循环，自动进食及饮水。所有动物随机分为4组，空白对照组(A组，6只):不做任何处理，自由饮用纯净水;胃泌素组(G组，6只):连续每天皮下注射胃泌素300μg/kg 共90 d;MNNG组(M组，6只):饮用含MNNG 100μg/ml的自来水;胃泌素与MNNG 合用组(M +G组，6只):饮用含MNNG 100μg/ml的自来水，同时连续每天注射胃泌素300μg/kg共90 d。

1.2 试剂 胃泌素(皮下注射用)购自Sigma 公司，为白色粉末，使用前用二甲基亚枫(DMSO)配制成浓度为0.4μg/μl的溶液;MNNG 由日本TCI 公司生产，保存于4℃冰箱。含MNNG的饮用水在使用前配制以防止其分解。饮水瓶外用锡箔纸包裹，用以避光;兔抗大鼠ki-67(增殖细胞核抗原)多克隆抗体购自Epitomics 公司;兔抗大鼠bcl-2(即B 细胞淋巴瘤/白血病-2基因)多克隆抗体购自Bioworld 公司，二抗兔/鼠通用型抗体和DAB(二氨基联苯胺或联苯二胺3，3'-diaminobenzidine tetrahydrochloride)显色液均购自Dako公司。

1.3 动物标本取材和染色 实验第90 天取材，处死前，大鼠禁食24 h，用2.5%戊巴比妥钠(2 ml/kg)腹腔注射麻醉动物，打开动物腹腔，取出大鼠胃组织，沿胃大弯切开，生理盐水清洗干净后，把标本固定于泡沫板上，肉眼观察胃黏膜大体形态变化，随后将胃组织固定于10%的中性甲醛溶液中，固定24 h 后，标本常规取材，每只动物在胃体、胃窦各取材两块，经组织脱水透明、浸蜡、包埋、切片(厚度5μm)，进行HE 染色，观察胃黏膜的组织病理学变化，并且在5 倍光学显微镜下，每张切片随机取10 处，测量胃泌酸区黏膜层的厚度，取其平均值(μm)。

1.4 大鼠胃组织免疫组织化学染色 上述石蜡切片，分别作bcl-2 抗体(1∶300)和ki-67 抗体(1∶300)的免疫组化染色，用磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS)代替一抗作为阴性对照，用公司提供的阳性反应组织作为阳性对照。具体步骤参照操作说明书进行。结果判定标准:①bcl-2 抗体阳性反应物主要位于细胞胞浆，凡细胞浆中出现明显的棕黄色颗粒为蛋白阳性细胞;②ki-67 定位于细胞核及有丝分裂细胞胞质，凡细胞核或细胞质呈棕黄色颗粒为阳性。每张切片按一定距离观察10个高倍视野进行细胞计数分析。将上述免疫组织化学结果用Image-Pro-Plus 6.0图像分析软件进行图像分析，细胞计数。

1.5 统计学处理 本实验所有数据使用SPSS 17.0软件进行处理。计量资料采用方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 M组和M +G组两组大鼠与对照组比较明显不活泼，食量减少;两组大鼠毛发松散，光泽度差，活动减少;G组和空白对照组比较无明显差异。

2.2 HE 染色 光镜观察组织细胞的排列方式、层数、腺细胞大小、细胞的异型性、胞核、核浆比有无异常、是否有癌细胞等。各组动物胃均未见异常。

2.3 4组大鼠胃黏膜厚度比较 A组、G组、M组和M+ G组的胃黏膜层厚度分别为:(785.43±98.3)μm、(964.70± 170.5)μm、(713.50± 92.3)μm、(817.68±109.5)μm。4组动物胃体黏膜层厚度差异有统计学意义(P＜0.05)，G组及M +G组动物与A组、M组相比，胃体黏膜层增加(见图1)。

图1 4组大鼠胃体HE 染色图(50×) A:A组;B:G组;C:M组;D:M+G组Fig 1 The gastric mucosa of four groups (50×) A:A group;B:G group;C:M group;D:M+G group

2.4 bcl-2、ki-67 在4组胃组织中的表达 2种抗体在4组胃组织中的表达见表1。bcl-2 抗体阳性反应物主要位于胞浆，呈棕黄色颗粒，经苏木素复染后胞核呈蓝色。方差分析，各组中bcl-2 含量有差别，其中A组与G组、M组、M +G组的组内比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。

ki-67 抗体阳性反应物主要位于胞核，呈棕黄色颗粒样沉淀，阴性反应胞核经苏木素复染后呈蓝色。然后在光学显微镜下进行观察，细胞计数。方差分析，各组中ki-67 含量有差别，其中A组与G组、M组、M+G组的组内比较差异有统计学意义(P＜0.05，见图2～3)。

表1 bcl-2及ki-67 在4组胃组织中的表达()Tab 1 The expression of bcl-2 and ki-67 in gastric tissues of four groups()

表1 bcl-2及ki-67 在4组胃组织中的表达()Tab 1 The expression of bcl-2 and ki-67 in gastric tissues of four groups()

注:与A组相比，* P＜0.05。

图2 4组大鼠胃窦bcl-2 免疫组化染色图(200×);图3 4组大鼠胃窦ki-67 免疫组化染色图(200×) A:A组;B:G组;C:M组;D:M+G组Fig 2 The expression of bcl-2 in four groups (immunohistochemical staining，200×);Fig 3 The expression of ki-67 in four groups (immunohistochemical staining，200×) A:A group;B:G group;C:M group;D:M+G group

3 讨论

胃泌素由分布于胃窦和十二指肠近端的G 细胞分泌，释放贮存于血液、组织和胃肠液当中，起着循环激素和神经递质的双重作用，除了可以刺激壁细胞和主细胞而促进胃酸、胃蛋白酶分泌外，还可以促进胃肠黏膜细胞的分裂增殖，增加DNA、RNA的合成和蛋白质的含量，并且可以营养胃肠道黏膜及壁细胞群，促进胃肠道黏膜的生长和加快黏膜更新速度等;还能增加胃黏膜血流量，有利于损伤组织的修复;还能促进胃窦运动，加速胃排空等［11］。近年来，由于抑制胃酸药物的广泛应用，其产生的高胃泌素血症的影响也越来越受到人们的关注。因此对高胃泌素血症的研究，有助于临床上对患者采取合理的治疗方式。

MNNG 是一种较为常见的引起癌变的活性致癌剂，它不依赖酶的代谢而直接作用于胃肠道黏膜上皮，使DNA 链上已有的碱基发生烷化产生突变，发挥其致癌作用［12］，它可诱发大鼠实验性胃癌，现已得到公认，本研究由于给药时间较短，并未诱导出胃癌。

bcl-2 是一种凋亡抑制基因，在肿瘤细胞的增殖中起重要作用，它是由Tsujimoto等［13］在人类滤泡型淋巴瘤研究中首先发现而命名，定位于人染色体18q21，长约230 000 bp［14］。bcl-2 蛋白是通过染色体内的转位活化而致其编码的蛋白产物过度表达，位于线粒体外膜、核膜和内质网膜上，主要通过抑制细胞色素C从线粒体向胞质释放，延长细胞寿命，从而阻断细胞凋亡的发生。本实验结果表明:无论是单独胃泌素组，MNNG组或者是两者共同作用时，bcl-2的表达均升高，且与空白组比较，其升高差异均有统计学意义(P＜0.05)。提示高胃泌素血症与细胞凋亡相关，能抑制细胞凋亡。凋亡减少导致肿瘤细胞存活更长时间，累积了致癌物。在癌前病变中亦可见异常的bcl-2 表达，且这一异常持续至癌症形成的整个过程中［15-16］。Kidd等［17］报道用洛克替丁处理动物后，内源性高胃泌素导致细胞增生/凋亡比例明显高于对照组和停药组，腺体中bcl-2的表达升高而Bax的表达则下降，提示高胃泌素与细胞的凋亡密切相关。

ki-67 是一种人类增殖细胞核抗原，通过测定细胞ki-67的表达，可以了解细胞的增殖情况。一般认为细胞呈现高增殖状态时，更容易形成肿瘤［18］。本实验结果表明:无论是单独胃泌素组、MNNG组或者是两者共同作用，ki-67的表达升高，且与空白组比较，其升高差异均有统计学意义(P＜0.05)，提示高胃泌素血症能够促进细胞增殖。胃泌素与其受体结合后通过细胞内信号传导可以促进某些原癌基因如c-myc、c-fos 以及细胞周期蛋白cyclinD1等的转录与表达，以促进胃肠道肿瘤细胞增殖。肿瘤细胞本身就能分泌释放胃泌素，同时又表达胃泌素受体，肿瘤细胞所产生的胃泌素与其自身的受体结合后，刺激肿瘤细胞的生长［19］。增殖的细胞更容易形成癌症，是因为内源性或者外源性致癌物增加了细胞内致癌物的累积。Gerdes［20］的研究也表明ki-67 抗原表达可反映肿瘤细胞的增生活性，与恶性肿瘤的发展、转移与预后高度相关。

本研究结果显示:G组动物出现了黏膜层增厚，提示胃泌素能促进胃黏膜生长，使黏膜层增厚。对高胃泌素血症的卓－艾氏综合征患者进行结肠镜检查和细胞增殖动力学的研究，结果表明长期高胃泌素血症可以促进肠道黏膜过度的增生而引起组织黏膜癌变［21］。胃泌素能促进胃黏膜生长增厚并且增加了ki-67及bcl-2的表达量，提示单独高胃泌素血症有可能通过促进细胞增殖及抑制细胞凋亡而最终导致肿瘤的形成。

目前，临床上常用的PPIs 类药物和H2－受体拮抗剂均可能在抑酸的同时导致胃泌素水平升高，胃食管反流病发病率的升高也会使这两类药物的使用增加。而且中国又是H.pylori 感染高发的国家，H.pylori的感染会进一步升高胃泌素的水平。对胃泌素及其受体的研究将为这两类药物使用期限、年龄范围，以及在使用前是否需要根除H.pylori，使用期间是否需要进行随访等，给予一定的临床指导意义。

［1］Parkin DM，Bray F，Ferlay J，et al.Global cancer statistics［J］.Cancer J Clin，2005，55(2):74-108.

［2］Soetikno R，Kaltenbach R，Yeh R，et al.Endoscopic mucosal resection for early c-ancers of the upper gastrointestinal tract［J］.J Clin Oncol，2005，23(20):4490-4498.

［3］Jensen RT.Consequences of long-term proton pump blockade:insights from studies of patients with gastrinomas［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2006，98(6):4-9.

［4］Kovac S，Anderson GJ，Baldwin GS.Gastrins，iron homeostasis and colorectal cancer ［J］.Biochim Biophys Acta，2011，1813 (5):889-895.

［5］Morton M，Prenderqast C，Barrett TD.Targeting gastrin for the treatment of gastric acid related disorders and pancreatic cancer ［J］.Trends Pharmacol Sci，2011，32(4):201-205.

［6］Wang J，Gao J，He J.Diagnostic value of ProGRP and NSE for small cell lung cancer:a meta-analysis［J］.Zhongguo Fei Ai Za Zhi，2010，13(12):1094-1100.

［7］Michael DB，Andrea V.Importance of gastrin in the pathogenesis and treatment of gastric tumors［J］.World J Gastroenterol，2009，15(1):1-16.

［8］Robertson DJ，Sandler RS，Baron JA，et al.Gastrin，Helicobacter pylori and colorectal adenomas［J］.Clin Gastroenterol Hepatol，2009，7(2):163-167.

［9］Qvigstad G，Waldum HL.Gastric cancer:Animal studies on the risk of hypoacid-ity and Hypergastrinemia［J］.World J Gastroenterol，2008，4(11):1646-1651.

［10］Orlando LA，Lenard L，Orlando RC，et al.Chronic hypergastrinemia:causes and consequences［J］.Dig Dis Sci，2007，52(10):2482-2489.

［11］Kleveland PM，Brenna E，Bakke I，et al.Interactions between gastric acid secretagogues and the localization of the gastrin receptor［J］.Scand J Gastroenterol，2009，44 (4):390-393.

［12］Naresse LE，Kobayasi S.Carcinogenesis of the upper gastrointestinal tract induced by N-methyl-N'-nitro-nitrosoguanidine and reflux of duodenal contents in the rat ［J］.Acta Cir Bras，2009，24 (2):112-117.

［13］Tsujimoto Y，Coxxman J，Taffe E，et al.Involvement of the bcl-2 gene in human follicular lymphoma ［J］.Science，1985，228(4706):1440-1443

［14］Riedel F，Gotte K，Schwalb J，et al.Vascular endothelial growth factor expression correlates with p53 mutation and angiogenesis in squamous cell carcinoma of the head and neck［J］.Acta Otolaryngol，2000，120(1):105-111

［15］Nakamura T，Nomura S，Sakai T，et al.Expression of bcl-2 oncoprotein in gastrointestinal and uterine carcinomas and their premalignant lesions［J］.Hum Pathol，1997，28(3):309-315

［16］Uesugi H，Saegusa M，Takano Y，et al.Different expression of Bcl-2 protein in gastric adenomas and carcinomas［J］.Pathol Int，1996，46(4):274-280.

［17］Kidd M，Tang LH，Modlin IM，et al.Gastrin-mediated alterations in gastric epithelial apoptosis and proliferation in a mastomys rodent model of gastric neoplasia ［J］.Digestion，2000，62 (2-3):143-151.

［18］Shinohara T，Ohshima K，Murayama H，et al.Apoptosis and proliferation in gastric carcinoma:the association with histological type［J］.Histopathology，1966，29(2):123-129.

［19］Kanda N.Involvement of cyclooxygenase-2 in gastric mucosal hype rtrophy in gastrin transgenic mice［J］.Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol，2006，290(5):519-527.

［20］Gerdes J.Ki-67 and other proliferation markers useful for immunohistological diagnosis and prognostic evaluations in human malignances［J］.Sem in Cancer Biol，1990，1(3):199-206.

［21］Schott M，Saqert C，Ramp U，et al.Carcinogenic hypergastrinemia:signet-ring cell carcinoma in a patient with multiple endocrine neoplasia type 1 with Zollinger-Ellison’s syndrome［J］.Clin Endocrinol Metab，2007，92(9):3378-3382.