用于目标序列染色体定位的镜鲤BAC-FISH体系构建

邓海霞 赵紫霞 徐 鹏 李 艳 王 书 孙效文

(1.大连海洋大学水产与生命学院, 大连 116023; 2.中国水产科学研究院生物技术研究中心, 北京 100141;3.中国科学院国家基因研究中心, 上海 200233)

荧光原位杂交(Fluorescencein situhybridization,FISH)是一种连接分子水平和细胞水平上遗传学研究的技术手段, 将标记后的核酸探针与染色体上的靶序列互补配对进行杂交, 经荧光显微镜显示出目标序列在染色体上的位置。目前 FISH技术在多个物种, 尤其是人类和植物基因组研究中已经得到了广泛应用, 例如细胞遗传图谱的构建[1—3], 杂种中亲本染色体的鉴定[4,5], 物种进化及亲缘关系的探讨[6,7], 转基因材料中外源基因的定位[8]等。FISH技术在水生动物中的应用还很有限, 仅有斑马鱼等模式生物开展了较为系统的细胞遗传学研究[9,10]。在其他水生生物中以端粒、核糖体DNA等重复序列的FISH 定位研究[11—14]为主, 但单拷贝基因常为长度在几kb左右的小片段DNA, 杂交信号检出率较低,技术难度较大。

1992年Shizuya,et al.[15]以大肠杆菌F因子为基础构建细菌人工染色体 (Bacterial artificial chromosome, BAC), 用于构建大片段基因组文库。采用BAC克隆作为探针进行染色体原位杂交, 能够有效克服单拷贝杂交信号弱的难题[16], 已在斑马鱼[10]、栉孔扇贝[17]等多个物种中获得了成功应用。2011年本课题组成功构建镜鲤 BAC文库[18], 包含 92160 个克隆, 平均插入片段长度为 141 kb。在该文库基础上, 本研究尝试构建镜鲤(Cyprinus carpiovar.specularis)BAC-FISH实验体系, 用于特定基因组片段的染色体定位, 在鲤鱼染色体鉴别、细胞遗传学图谱构建和鲤科鱼类比较基因组研究中具有广泛的应用前景。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验用鱼采自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所松浦实验基地, 包括一龄镜鲤 5尾, 体长14.7—19.2 cm, 体重 42—106 g。

1.2 有丝分裂中期染色体制备

实验鱼在25oC恒温水族箱内暂养48h以上后,腹腔注射植物血凝素(上海世泽生物科技有限公司),剂量为 60 μg/g鱼体重。18h后腹腔注射秋水仙素(Sigma-Aldrich), 剂量为 6 μg/g鱼体重。2h后剪尾鳍放血, 取体肾组织, 空气干燥法制备有丝分裂中期染色体, 保存于−80℃冰箱。

1.3 包含目标序列的BAC克隆筛选

使用PCR法在本课题组已构建的BAC文库筛选池[20]中筛选包含目标序列的BAC克隆, 目标序列包括斑马鱼微卫星标记Z6884 (GenBank： G41132.1)、Z4268 (GenBank： G41493.1)以及黄河鲤雄性特异性RAPD标记 CCmf1 (GenBank： FJ151368.1)。使用GenBank序列信息中所提供的引物。

根据筛选池筛选结果, 从原始BAC文库中挑取包含目标序列的克隆, 涂布 LB平板挑取单克隆并PCR验证, 避免保存过程中的菌株污染影响 FISH定位结果。

1.4 BAC质粒探针制备

目标BAC克隆接种于2×YT液体培养基, 37℃培养过夜。碱裂解法提取质粒,BamHⅠ(NEB)和EcoRⅠ(NEB)双酶切处理20min, 乙醇沉淀纯化。使用Nick Translation Kit (Roche)试剂盒对质粒DNA进行生物素或地高辛缺刻平移标记, 标记试剂分别使用 Biotin-11-dUTP (MBI)和 Digoxin-16-dUTP (Roche)。标记后加入DNA封闭剂大肠杆菌tRNA (Roche)和鲑精DNA (Sigma-Aldrich), 再次进行乙醇沉淀纯化,溶于去离子甲酰胺(上海生工)。

1.5 C0t-1DNA制备

酚氯仿抽提法制备镜鲤基因组DNA, 配制成包含0.3 mol/L NaCl的工作液, 0.1 MPa高压处理3min使 DNA片段大小下降到 100—1000 bp 范围内。DNA置 94℃变性 10min, 冰上 10S后转移到65℃复性, 调整复性时间使C0t=1。本例中DNA浓度为210 ng/mL, 故65℃复性27min。复性结束后加入SⅠ核酸酶(MBI)消化尚未复性的单链 DNA, 用量为 1 U/μg DNA, 37℃保温 10min, 加入 10 μL 0.5 mol/L EDTA, 70℃ 10min终止反应, 酚仿醇抽提纯化, 溶于去离子甲酰胺。

1.6 染色体荧光原位杂交

染色体片65℃老化6h以上, 用0.5 mg/mL RNA酶 37℃处理30min, 卡诺氏固定液固定 5min, 置于含70%甲酰胺的4× SSC 中72℃变性2min, 迅速转入−20℃梯度乙醇脱水。

将BAC探针和C0t-1DNA混合, 78℃变性10min,迅速置于冰上。配制杂交液, 组分为 5 ng/μL BAC质粒探针, 50 ng/μL C0t-1DNA, 125 ng/μL 大肠杆菌tRNA, 125 ng/μL 鲑精 DNA, 2 μg/μL 小牛血清白蛋白(上海生工), 10%硫酸葡聚糖(Amresco), 50%去离子甲酰胺和4× SSC, 37℃预杂交30min。

每张染色体片滴加50 μL杂交液, 37℃杂交18h,杂交结束后用含50%甲酰胺的2× SSC溶液42℃洗涤 20min, 依次移入2× SSC、1× SSC和4× SSC洗涤。

1.7 荧光染色及信号放大

对于生物素标记的探针杂交片, 依次加入FITC标记的亲和素(Sigma-Aldrich)、生物素标记的亲和素抗体(Vector)、FITC标记的亲和素进行反应; 对于地高辛标记的探针杂交片, 依次加入鼠抗地高辛抗体(Sigma-Aldrich)、TRITC标记的兔抗鼠抗体(Sigma-Aldrich)、TRITC标记的羊抗兔抗体(Sigma-Aldrich)进行反应, 使用各产品说明书推荐剂量。每次 37℃避光反应1h, 反应结束用含有1% Triton的4×SSC三次洗脱, 洗去未结合试剂。

1.8 杂交信号的荧光观察

每张载玻片滴加50 μL含有5 ng/μL DAPI (或PI), 20 mg/mL DABCO, 100 mmol/L Tris(pH8.0),90 %甘油的荧光染色剂, 室温3min后盖片, 指甲油封片, 4℃染色 8h后使用 Imager.M2荧光显微镜(Zeiss)观察。

2 结果

2.1 包含目标序列的BAC克隆筛选

在 BAC克隆池中筛选包含斑马鱼微卫星标记Z6884的BAC克隆, 板池中P61位置、行池中R05位置和列池中 C07位置显示扩增阳性, 表示阳性克隆位于第61板第5行第7列, 克隆号为CYC061E07。在原始文库中挑取该克隆PCR验证, 证实该克隆包含目标序列斑马鱼微卫星标记Z6884。

用同样方法筛选获得包含斑马鱼微卫星标记Z4268的BAC克隆CYC024C12, 含黄河鲤雄性特异性随机扩增片段长度多态性(Randomly Amplified Polymorphic DNA, RAPD)标记CCmf1的BAC克隆CYC010F24、CYC031A10、CYC036M11。值得注意的是CCmf1在筛选池中出现了不少于6个阳性信号, 本研究仅在信号最强的三块板CYC010、CYC031和CYC036中进行了二次筛查获得 3个克隆, 其实际克隆数应更多。

2.2 微卫星标记Z6884的FISH定位

使用地高辛标记镜鲤BAC克隆探针CYC061E07,经红色荧光染料TRITC显色和信号放大, 显微镜照片表明该克隆定位于镜鲤一对近中着丝粒染色体长臂中部(图1A)。

2.3 微卫星标记Z4268的FISH定位

使用地高辛标记镜鲤BAC克隆探针CYC024C12,经红色荧光染料TRITC显色和信号放大, 显微镜照片表明该克隆定位于镜鲤一对端着丝粒染色体着丝粒附近(图1B)。

2.4 RAPD标记CCmf1的FISH定位

使用地高辛标记镜鲤BAC克隆探针CYC010F24,经红色荧光染料TRITC显色和信号放大; 使用生物素标记镜鲤 BAC克隆探针 CYC031A10, 经绿色荧光染料 FITC显色和信号放大。显微镜照片表明CCmf1定位于镜鲤的不少于四对同源染色体上, 且四对同源染色体之间形态和定位位置有明显差异(图 1 D、F)。

图1C为地高辛标记 CYC010F24, 杂交液中不含C0t-1 DNA的染色结果照片, 染色体上存在大量未被封闭的杂交信号; 图 1E为生物素标记CYC031A10, 亲和素-FITC单次染色, 不经信号放大的显微镜照片, 杂交信号不可见。

3 讨论

3.1 BAC-FISH实验条件优化

在本研究中BAC-FISH实验体系以冷泉港实验操作手册[19]中提供的方法为基础, 针对具体实验对象和研究目的, 结合其他文献方法, 对实验条件做了以下探索和优化调整。

图1 镜鲤 BAC 克隆 CYC061E07、CYC024C12(B)、CYC010F24(C、D)和CYC031A10 (E、F)的FISH定位Fig.1 FISH localization of mirror carp BAC clone CYC061E07(A, containing zebrafish microsatellite marker Z6884), CYC024C12 (B,containing zebrafish microsatellite marker Z4268), CYC010F24 (C,D, containing Yellow River carp male-specific RAPD marker CCmf1) and CYC031A10 (E, F, containing Yellow River carp male-specific RAPD marker CCmf1)

染色体片的前处理 按照原有方法, 染色体片固定后直接变性杂交, 视野中染色体之外的区域也出现了大量的染色信号, 可能由于制片材料头肾细胞中RNA含量丰富, 对结果造成了干扰。参考文献[1]中的方法使用 RNaseA 和蛋白酶预处理, 结果视野中染色体数量明显减少, 染色体在盖玻片边缘聚集, 可能是因为蛋白酶破坏了染色体在玻片上的附着。最终确定仅用0.5 mg/mL RNAase A处理, 能够明显降低染色体区域外的杂信号干扰。在杂交染色和信号放大等一系列反应和洗脱处理之后, 染色体形态往往变得模糊, 在染色体片前处理阶段增加65℃老化处理步骤, 能够有效维持染色体形态。

BAC质粒探针制备 碱裂解法提取 BAC质粒后直接进行缺刻平移标记制备探针, 杂交后信号检出率较低; 本研究在标记探针前对BAC质粒进行双酶切处理, 信号检出率有明显提高。可能是因为双酶切处理后质粒 DNA被片段化, 尤其是原来处于闭环超螺旋状态的质粒被切断, 同时探针长度变短,使标记效率和杂交效率都有所提高, 从而提高了信号检出率。

C0t-1 DNA封闭基因组重复序列 C0t-1 DNA是富集了本物种重复序列的DNA混合制品。将基因组DNA物理打断至100—1000 bp的范围内, 94℃变性后控制复性时间使 C0t=1, 此时大部分重复序列复性为双链, 非重复序列仍维持单链状态, 使用SⅠ核酸酶消化单链DNA, 则C0t-1 DNA主要成分为基因组中的重复序列[20]。在杂交液中加入10倍于BAC质粒探针含量的C0t-1 DNA, 能够封闭探针中可能存在的重复序列, 并与基因组 DNA 进行竞争性杂交, 使探针仅与染色体上实际对应位点发生杂交反应。使用BAC探针进行FISH定位的部分文献中无需使用C0t-1 DNA封闭即可实现成功定位[21,22],也有文献指出不使用C0t-1 DNA封闭会导致整个基因组均匀着色, 从而使杂交信号无法识别[17]。而在镜鲤BAC探针CYC010F24 的定位过程中我们则发现, 不使用 C0t-1 DNA封闭时, 染色体上会出现与杂交信号形态相似的着色点(图1C)。如果杂交效率较低, 着色点数量不多, 或预期目标序列为重复序列时, 这些着色点非常容易与真正的杂交信号混淆,形成误导性的假阳性结果, 因此C0t-1 DNA封闭对镜鲤BAC-FISH实验体系是不可或缺的步骤。

预杂交 本研究在变性的探针与染色体杂交之前, 增加了探针 37℃预杂交 30min的步骤, 目的是使探针中的重复序列先行复性为双链, 避免与基因组DNA杂交。预杂交操作需要与C0t-1 DNA封闭配合进行, 当杂交液中不存在大量 C0t-1 DNA, 仅有探针、鲑精DNA和tRNA时, 预杂交操作并不能获得明显效果。

荧光染料的选择 本研究使用了两种杂交信号荧光染料, 分别为呈绿色荧光的 FITC和呈红色荧光的 TRITC; 使用了两种染色体荧光染料, 分别为呈蓝色荧光的 DAPI和呈红色荧光的 PI, 这些荧光染料各具优缺点。在显微镜下FITC的信号较强, 无论在DAPI的蓝色背景下, 还是在PI的红色背景下都容易辨认, 但缺点是拍摄的照片双色叠加后不易辨识, FITC的绿色与DAPI的蓝色本身对比不强烈,当杂交信号较弱时容易被照片上蓝色的染色体所掩盖, 而FITC的绿色与PI的红色叠加呈黄色, 在红色的染色体照片上更不易分辨(图1F)。红色的TRITC与蓝色的DAPI对比鲜明, 二者叠加后呈桃红色, 在蓝色染色体照片上也容易辨识, 缺点是信号较弱,猝灭也很快, 在显微镜下查找杂交信号较难。在后续研究中需要寻找更适合杂交信号染色和放大的红色荧光染料。DAPI与PI的染色效果没有明显优劣差别, DAPI的实用性更高, 因为它能够与红色和绿色的荧光染料共用, 从而实现两种不同探针的双色FISH共定位, 使用 PI对染色体着色后则无法再使用红色荧光染料对杂交信号进行染色。

信号放大 不少 FISH实验中用荧光染料直接标记探针, 或用荧光染料对标记探针进行单次染色,无需信号放大[3,23,24]。本研究在信号较强的FITC染色系统中尝试单次染色, 但未观察到荧光信号(图1E)。这表明在现有镜鲤BAC-FISH实验体系中, 加入抗体进行信号放大仍然是必要的步骤。

通过条件优化调整, 本研究构建的 BAC-FISH实验体系能够成功实现已知基因组片段在镜鲤染色体上的准确定位。定位对象既包括在染色体上有单一定位位点的序列, 如微卫星标记Z6884和Z4268,也包括在染色体上有多个定位位点的序列, 如RAPD标记CCmf1。

3.2 斑马鱼微卫星标记在镜鲤染色体上的定位

大多数鲤科鱼类的染色体数目为 50条(以斑马鱼为典型代表)或 48条(以草鱼为典型代表)[25], 而鲤鱼、鲫鱼等部分物种染色体数目达到 100条, 即具有50对同源染色体。因此不少研究者推测, 鲤科鱼类原始类群在进化过程中经历了一次染色体数目整体加倍事件, 在此基础上进一步演化形成了鲤鱼等现代物种[26]。

在这一假设之下, 每条斑马鱼染色体应当与两条鲤鱼染色体相对应。我们选取了位于斑马鱼17号染色体上的两个微卫星标记 Z6884和 Z4268, 在镜鲤染色体上开展了 BAC-FISH定位, 结果显示二者各自定位于一对同源染色体上, 两对同源染色体之间有明显形态差异。在已发表的鲤鱼遗传连锁图谱上[27], 这两个微卫星标记也位于不同的连锁群(Linkage Group, LG), Z6884位于LG3, 而Z4268则位于LG20。

两个斑马鱼微卫星标记在镜鲤染色体上的BAC-FISH定位结果为鲤鱼染色体数目加倍的进化假设提供了一项直接实验证据, 同时也将现有的遗传连锁图谱与具体的染色体对应起来, 可作为染色体识别和细胞遗传学图谱构建的依据。

3.3 黄河鲤性别相关标记在镜鲤染色体上的定位

常重杰课题组 2009年报道了一个黄河鲤雄性特异性RAPD标记CCmf1, 并推测其为与性染色体进化早期阶段相关的重复序列[28,29]。本研究在BAC文库筛选过程中发现多个包含该片段的克隆, 进一步证实了该序列在基因组中拷贝数较多, 属于重复序列。通过CYC010F24和CYC031A10两个克隆的BAC-FISH定位, CCmf1标记被定位于不少于四对同源染色体上, 这些染色体的鉴别可能为性别决定基因筛查指引方向, 同时也可能为性染色体进化研究提供重要线索。

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