甲胺磷生物降解酶对韭菜中农残生物修复效果研究1）

张娜，郭庆启，刘晓飞，黄文秀，宋琨，王双，李爽

（1.哈尔滨商业大学 食品工程学院，黑龙江省食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076；2.东北林业大学 林学院，哈尔滨 150040）

甲胺磷农药（MAP）杀虫谱广，毒性大，制作工艺简单，曾是我国使用量最大的农药品种，由于其生产和使用对环境和人体可能造成巨大的污染［1］，国家已经禁止生产使用该农药。但是，甲胺磷农药屡禁不止，2007年重庆多种蔬菜中发现甲胺磷农药，2012年8月苏州生菜中发现甲胺磷农残超标，2007年在烟台，2012年在青岛分别发现千余吨含有甲胺磷农残的毒韭菜［2－4］如何从根本上安全而有效的消除甲胺磷农残的危害，是近年来众多科研人员所关注的［5－7］。本研究利用实验室分离得到的一株微生物代谢产生甲胺磷农药降解酶（MAPE），利用该酶液对在生长过程中喷洒甲胺磷农药的毒韭菜进行分析，优化降解工作参数，为甲胺磷农残的有效去除奠定了科研基础。

1 实验部分

1.1 实验材料与仪器

1.1.1 供试菌株

实验室中分离得到XY－C菌株，该菌株为葡萄球菌属（Staphylococcus Rosehbach）［8］。

1.1.2 实验仪器

SPX－70B型摇床振荡培养箱，天津泰斯特仪器有限公司；722型分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；SYQ－DSX－280A型不锈钢压力蒸汽灭菌锅，上海申安医疗器械厂；101型电热鼓风干燥箱，东联电子技术开发有限公司。

1.1.3 实验材料

甲胺磷农药：产自郑州兰博尔科技有限公司；规格为300g／500mL；有效成分为40%。甲胺磷标准品：上海农药研究所提供。其余试剂均为分析纯。种植时喷洒甲胺磷农药的韭菜为实验性原料，购于黑龙江省富裕县。

1.2 实验方法

1.2.1 培养基的组成

无机盐培养基：NaCl 0.5g，MgCl20.5g，K2SO40.5g，CaCl20.1g，FeSO40.01g，MnSO40.001g，蒸馏水1000mL，pH7.0灭菌后，再加入0.5mL甲胺磷农药。

1.2.2 粗酶液的提取

将实验室分离出来的降解甲胺磷农药的菌株XY－C，接种于无机盐培养基，在28℃，180r／min的摇床中振荡培养72h后将液体培养基4000r／min离心处理，取上清液，即为粗酶液。

1.2.3 甲胺磷含量的测定

待测样品经过前处理后，精确称取待测样品的分解液2mL，以试剂空白作参比，其余操作步骤同标准曲线。测其吸光度值，计算出磷的含量，再根据计算出来的总磷和无机磷的量，用两者之差算出样品中有机磷的含量［9］。

1.2.4 降解率公式

式中：m1—酶液反应时间为零时所测得的无机磷含量，mg／L；m2—酶液与韭菜反应后测定的无机磷含量，mg／L；d—韭菜中甲胺磷农残的降解率，%；x—韭菜中有机磷的含量，mg／L；y—韭菜中总磷的含量，mg／L。

1.2.5 韭菜中甲胺磷农残生物降解工艺参数的确定

每隔一段时间在韭菜表面喷洒不同体积的的粗酶液，于不同温度下存放不同时间后，分别依照不同处理，取回样品，去掉非可食部分，用滤纸擦净蔬菜表面的泥沙，用刀切碎，混匀。用电子天平准确称取10g样品，加入10mL水用组织捣碎机切碎充分混合、打浆，每个样品打3份原浆，用于平行试验，进行总磷和无机磷测定，并计算甲胺磷农残的降解率［10］。

2 结果与讨论

在吸光度740nm时，通过比色法测定无机磷和总磷含量。吸光值与磷含量呈现一定的线性关系，所得的方程为y（吸光值）＝0.1247x（无机磷浓度，mg／L）＋0.0088，R2＝0.9995。说明无机磷标准溶液浓度同吸光值之间线性关系良好，该方程可以用于测定韭菜中无机磷的含量。

2.1 喷洒次数对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

图1 喷洒次数对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

对在种植过程中喷洒了甲胺磷农药的韭菜在其成熟后，每隔30min喷洒一次甲胺磷农药降解酶液10mL，于室温下反应，对喷洒酶液的韭菜进行粉碎、脱色，测定甲胺磷含量并计算甲胺磷农药降解率，结果如图1所示。随着喷洒次数的增多，韭菜中甲胺磷农残降解率不断升高，在韭菜表面喷洒1次粗酶液对韭菜中的甲胺磷农残的降解率为31.41±1.01%，而在韭菜表面喷洒5次粗酶液后，韭菜中的甲胺磷农残的降解率提高为66.33±0.50%，在喷洒3次之后，这种降解率提高的情况出现减慢趋势，因此，选择甲胺磷降解酶对韭菜的喷洒次数为3次。

2.2 粗酶液使用量对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

图2 MAPE使用量对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

对在种植过程中喷洒了甲胺磷农药的韭菜在其成熟后，喷洒甲胺磷农药降解酶，均喷洒3次，每100g韭菜上每次喷洒5～25mL，于室温下反应，对喷洒酶液的韭菜进行粉碎、脱色，测定甲胺磷含量并计算甲胺磷农药降解率，结果如图2所示。

随着甲胺磷农药降解酶使用量的增多，韭菜中甲胺磷农残降解率不断升高，在韭菜表面喷洒3次每次5mL的粗酶液对韭菜中的甲胺磷农残的降解率为30.97±1.70%；而在韭菜表面喷洒3次每次25mL的粗酶液后，韭菜中的甲胺磷农残的降解率提高为64.74±0.76%；在喷洒每次20mL的粗酶液后，虽然降解率在逐渐升高，但是降解率升高并不是十分明显。从实验数据可以看出在不同的酶液添加量的反应体系中，底物浓度不变的情况下，在酶液添加量较少时，降解率随着酶液添加量的增加而增加，降解速率也较快，两者呈正比关系；随着酶液添加量进一步的增加，降解率有小幅度的增加，降解速率明显下降，这可能与底物中酶含量过多，底物与酶中心迅速结合，导致酶活性受抑有关。因此，选择20mL甲胺磷降解酶对100g韭菜进行喷洒降解。

2.3 作用温度对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

对种植过程中喷洒了甲胺磷农药的韭菜在其成熟后，喷洒甲胺磷农药降解酶，于不同温度下反应，对喷洒酶液的韭菜进行粉碎、脱色，测定甲胺磷含量并计算甲胺磷农药降解率，结果如图3所示。

图3 温度对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

随着作用温度由4℃不断增加到65℃，韭菜中甲胺磷农残降解率出现先升高后降低的变化趋势，在45℃对韭菜中甲胺磷农残进行降解时的降解率为64.63±1.25%，比4℃和65℃作用环境下，韭菜中的甲胺磷农残的降解率分别提高6.4倍和1.67倍。因此，选择45℃进行甲胺磷降解酶对100g韭菜进行喷洒降解。

2.4 作用时间对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

对种植过程中喷洒了甲胺磷农药的韭菜在其成熟后，喷洒甲胺磷农药降解酶，反应不同时间后对喷洒酶液的韭菜进行粉碎、脱色，测定甲胺磷含量并计算甲胺磷农药降解率，结果如图4所示。

图4 作用时间对韭菜中甲胺磷农残的降解效果的影响

随着作用时间的增多，韭菜中甲胺磷农残降解率不断升高，在作用20min后，甲胺磷农残降解率增加并不显著，反应30min后甲胺磷农残的降解率为67.17±1.17%，比反应20min时甲胺磷农残的降解率仅提高了2.5%。而反应20min后甲胺磷农残的降解率为64.63±1.25%，比反应15min和反应5min时甲胺磷农残的降解率分别提高4.3%和10.1%。因此，选择20min作为反应时间，进行甲胺磷降解酶对100g韭菜的降解。采用单因素试验得到的各工艺参数喷洒三次每次20mL的甲胺磷农药降解酶于45℃反应20min，得到的甲胺磷农残降解率高达68.74±0.86%。

3 结论

采用单因素试验得到的各工艺参数，喷洒3次，每次20mL的甲胺磷农药降解酶于45℃反应20min，得到的韭菜中甲胺磷农残降解率高达67.17±1.17%。

［1］陈巧莲.降解甲胺磷菌株的筛选及其特性的研究［D］.海口：海南大学，2003.

［2］仲维科，孙梅心，陈雁玲.中国食品的农药污染问题［J］.农药，2000，39（7）：2－3.

［3］朱继红.有机磷中毒的历史与现状［J］.中国社区医师杂志，2006，1（4）：23－25.

［4］毒饺子事件中日分歧依旧.食品贸易税锐减三成［DB／OL］.［2008－4－14］.http：／／mranz.cnca.gov.cn／caitbbs／topic.jsp？forumID＝61＆topic＝145.

［5］邱道骥，赵启红，刘红，等.环境中有机磷农药降解方法的研究进展［J］.化工时刊，2006，20（3）：64－67.

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［9］朱静平，刘兴艳，马建华.等.应用磷钼蓝分光光度法测定红橘中有机磷［J］.广西农业科学，2005，21（4）：351－355.

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