双水相体系萃取分离熊猫豆蛋白质

杨秋慧子，孙亚莉，张喜峰，*

(1.南京农业大学食品科技学院，江苏南京210095;2.河西学院农业与生物技术学院，甘肃张掖734000)

“熊猫豆”是我国河西走廊的珍稀名贵彩色豆种。形状、口感独特，营养丰富，易熟，经济价值高［1］。蛋白质含量高达34.5%。熊猫豆氨基酸种类齐全，人体中不能合成的8 种必需氨基酸中，除色氨酸和蛋氨酸含量稍低外，其余6 种含量均高，尤以赖氨酸含量丰富。目前我国对熊猫豆中蛋白质的研究相对较少［2］。传统提取蛋白质常采用硫酸铵沉淀法、溶剂提取法、等电点沉淀法等存在样品处理量小、回收率较低、操作繁琐、周期较长的缺点。双水相萃取操作条件温和、处理量大、易于连续操作、且蛋白质能保持其天然的空间构型，不易失活［3］。本实验以熊猫豆为实验材料，采用Plackett-Burman 实验、最陡爬坡实验、中心组合设计对双水相萃取分离熊猫豆蛋白质的条件进行优化。促进熊猫豆蛋白功能食品加工可持续发展，以期为熊猫豆蛋白利用开辟新的途径，为其工业化提取熊猫豆蛋白质奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

熊猫豆 购于张掖市甘州区新乐超市;PEG(600、1000、2000、4000、6000)、硫酸铵、牛血清蛋白、考马斯亮蓝G-250、磷酸、95%乙醇、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、氯化钠 均为分析纯。

粉碎机 河北黄骅新兴电器厂;PL203 电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;XO-SM50超声-微波反应系统 南京先欧仪器制造有限公司;DKB-501 数显超级恒温水浴锅 扬州市三发电子有限公司;DHG-9101.1 电热恒温鼓风干燥箱 扬州市三发电子有限公司;722 型分光光度计 上海光谱仪器有限公司;CR-21 高速离心机 日本日立;漩涡混合器 上海精科实业有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 熊猫豆中蛋白质的粗提取 称取熊猫豆粉末5g，加入100mL pH7.0 的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液，超声- 微波提取5min，将得到的悬浊液于6000r/min 离心10min，倾倒上清液可得到含蛋白质的粗提液，测定粗提液中蛋白质含量。

1.2.2 考马斯亮蓝G-250 测定蛋白含量［4］5 支试管中，分别精确吸取120μg/mL 牛血清蛋白原液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，用蒸馏水全部稀释至1.0mL，然后分别加入5.00mL 考马斯亮蓝溶液，混合均匀，于(25 ±1)℃的恒温水浴中保温10min，冷水浴中冷却后，立即于595nm 波长处比色测定。以1.0mL蒸馏水代替样品液，加入5.00mL 考马斯亮蓝溶液，其余操作同上，做空白对照。

1.2.3 双水相系统相图制作［5］精确称取质量分数为50%的不同相对分子质量的PEG 于试管中，加入1g ddH2O，用滴定管缓慢滴加已配好的质量分数为40%(NH4)2SO4溶液，并在漩涡混合器上混合，观察溶液的澄清程度，直至试管中溶液开始出现浑浊为止。记录(NH4)2SO4的加量(g)。然后加水，使其澄清，继续向试管中滴加(NH4)2SO4溶液并不断混匀，直至再次达到浑浊，如此反复操作。计算每次达到浑浊时，PEG 和(NH4)2SO4在系统总量中的质量分数(g/g)，以PEG 的质量分数为纵坐标，(NH4)2SO4的质量分数为横坐标作图，即得到一条双节线。

1.2.4 双水相萃取方法 固定体系总质量为10.00g，加入适量的PEG、(NH4)2SO4、粗蛋白提取液，充分振荡使成相物质溶解，同时完成了熊猫豆蛋白在双水相系统中的分配过程，在一定条件下萃取。此双水相系统静置一定时间，当两相达到相分离，熊猫豆蛋白质富集于双水相系统的上相中，读取上下相体积，求相比R;分别测定上下相蛋白质浓度，计算熊猫豆蛋白质的分配系数K 及萃取率Y，如下式:

1.2.5 Plackett-Burman(PB)实验设计 在前期实验的基础上，选取可能影响双水相萃取蛋白质的7 个因素进行Plackett- Burman 设计，每个因子取高(+1)和低(-1)2 个水平，响应值为萃取率(Y)。实验因素、水平及编码见表1。

表1 Plackett-Burman 实验设计因素水平范围Table 1 Factors and levels in the Plackett-Burman design

1.2.6 最陡爬坡实验 响应面拟合方程只有在考察区域里才能充分近似真实情况，所以先逼近最大萃取率区域后才能建立有效的拟合方程。根据PB 实验筛选出显著因子，进行最陡爬坡实验，以期寻找到最大萃取率。

1.2.7 星点设计实验 为在最大响应区研究影响蛋白质萃取率的因素，根据星点设计实验原理，进行二因素三水平响应面分析实验，各因素及其水平见表2。

表2 星点设计实验因素水平及其编码Table 2 Levels of variables used in the Central composite design

2 结果与讨论

2.1 标准曲线的绘制

用紫外可见分光光度计测595nm 处吸光度，绘制蛋白总量-吸光度标准曲线，以试管中牛血清白蛋白的总量(mg)为横坐标，相应的吸光度值(A)为纵坐标作标准曲线，得到其线性方程为y =5.606x +0.0265(R2=0.9942)。

2.2 双水相体系相图

在室温条件下，对相对分子质量分别为600、1000、2000、4000、6000 的PEG/(NH4)2SO4相图进行绘制，结果见图1 所示。

图1 不同相对分子质量PEG 与(NH4)2SO4 的双水相相图Fig.1 Phase diagrams of different molecular weight PEG/(NH4)2SO4 in aqueous two-phase system

在室温条件下，测定不同分子量PEG/(NH4)2SO4双水相体系相图，结果见图1。考虑到萃取是在两相条件下进行的，因此选择在双节线上方的质量分数点作为单因素的参考条件。当(NH4)2SO4质量分数一定时，随着PEG 相对分子质量的增大，形成双水相体系所需PEG 的浓度降低。因为PEG 相对分子质量越大，其憎水程度越强，且加大与(NH4)2SO4分相的动力，导致临界分相浓度降低［6］。

2.3 PEG 相对分子量对双水相萃取蛋白质分配行为的影响

固定PEG 的质量分数为20%，(NH4)2SO4的质量分数为20%，考察PEG 相对分子量对熊猫豆中蛋白质萃取效应的影响，结果见图2。

图2 PEG 相对分子质量对熊猫豆中蛋白质萃取率的影响Fig.2 Effect of PEG molecular weight on extraction yield of protein from Phaseolus coccineus L

随着PEG 相对分子量的增大，相黏度增大，成相物质分子的空间阻碍作用增加［7］。由图2 可知，增大PEG 的相对分子质量，熊猫豆中蛋白质的分配系数和萃取率总体呈现下降的趋势，是因为PEG 分子量减小时，它的疏水性显著减弱，使熊猫豆蛋白在上相的表面张力减小，从而易于向上相分配［8］。综合考虑5 种PEG 中，PEG600 的萃取效果最好，并且熊猫豆蛋白质在PEG600-(NH4)2SO4体系中的分配系数最高，故选PEG600 为双水相系统成相物质。

2.4 Plackett-Burman 设计及实验结果

Plackett-Burman 设计及实验结果表3。

利用Design-Expert 7.16 软件对Plackett-Burman实验结果进行方差分析，各因素的影响效果见表4。由表4 可见，X3(pH)和X4(温度)对萃取率的影响最为显著，而且pH 和温度的效应值为正，而其它因素对蛋白质萃取影响较小，故在下一步响应面分析中只考察pH 和温度的最优水平。

表3 Plackett-Burman 实验设计及结果Table 3 Plackett-Burman experiment design and corresponding results

表4 PB 实验参数估计表Table 4 Coefficient estimates of variables in PB design

2.5 最陡爬坡实验(Steepest ascent design)确定因素水平

由表4 各因素影响值可看出，要提高熊猫豆蛋白质萃取率，应增大pH 并且提高温度对提高萃取率有促进作用。以X3(pH)和X4(温度)两个因素的正负效应确定下一步实验的变化方向、步长，具体取值和实验结果见表5。随着两个重要因素的不同变化，蛋白萃取率的变化趋势是先上升后下降，其中在3 号水平上达到最大值，所以判断最优萃取条件在3 号水平附近，故选此水平为中心点进行后续的响应面设计。

表5 最陡爬坡实验设计及结果Table 5 Steepest ascent design and corresponding results

2.6 中心组合设计及结果

爬坡实验中的3 号实验条件作为响应面实验因素水平的中心点进行响应面实验设计。以二因素三水平进行响应面中心组合实验，结果见表6。

表6 中心组合实验设计及结果Table 6 Central composite design and corresponding results

依据响应面设计方法，使用 Design -Expert.8.0.5.0 软件得到编码空间二元二次函数模型:Y =42.84-0.97A +0.12B +1.12AB-15.04A2-3.77B2，方差分析及F 检验结果列于表7。

由表7 可知，本模型拟合程度明显，其F 值为37.43，p ＜0.0001，说明模型极显著;同时模型中参数A2极显著，B2显著。同时对比两个因素的F 值可以看出，pH 的影响较温度更大。对其失拟检验的p =0.4778 ＞0.05，不显著，说明模型中不需要引入更高次数的项。决定系数R2=0.9640，表明96.40%的变化可由此模型解释。

2.7 显著因素水平的优化

利用Design-Expert 软件根据回归方程进行响应面分析，绘制响应面图，结果如图3 所示，利用Design-Expert 软件对蛋白质萃取率的二次多项式数学模型进行求导，可获得该模型极值点，对函数进行分析，得到最优的萃取条件为pH 为7.0、温度为35℃、PEG600 质量分数为15%、(NH4)2SO4质量分数为20%、NaCl 质量分数为0.05%、蛋白样品溶液加入量4mL、萃取90min，熊猫豆蛋白质萃取率达42.85%。为了验证模型预测的准确性，在最佳萃取条件下做实验，实际萃取率为43.69%，可见该模型能较好地预测实际萃取情况。

表7 回归分析结果Table 7 Results of regression analysis

图3 温度与pH 交互作用对蛋白质萃取率影响的响应面图Fig.3 Response surface showing the effect pH value and temperature on protein extraction yield

3 结论

采用Plackett-Burman 设计、最陡爬坡实验、响应面法，确定双水相体系组成为PEG600 质量分数为15%、(NH4)2SO4质量分数为20%、pH 为7.0、萃取温度35℃、萃取90min 时，熊猫豆蛋白质萃取率可达43.69%。因此，利用响应面分析方法对熊猫豆蛋白质的萃取条件进行优化，可以获得最优的工艺参数，能有效的减少工艺操作的盲目性，从而为进一步的实验研究奠定基础。

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