稠李属三种果实花色苷对HepG2 细胞的增殖抑制作用比较

辛 越，刘 荣 ，何 娇，臧 云

(东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040)

稠李(Padus racemosa)、山桃稠李(Prunus maackii)又名斑叶稠李，紫叶稠李 (Padus virginiana)，为蔷薇科(Rosaceae)稠李属的三种植物，主要分布于北温带，多年生落叶乔木［1］。花期在4～6月，总状花序，花瓣密集呈白色，果期在5～10 月，果实未成熟时呈绿色，味涩，成熟后呈紫黑色，味甜，肉多、汁多，果核坚硬［2］。稠李属植物因较耐湿寒，在我国黑龙江、吉林、辽宁、内蒙古、河北、山西、河南、山东等地均有分布，树皮、叶、花和果可入药，树干可做木材，用途广泛，并花香浓郁，为早春观赏植物之一［3］。近年来，随着人们对保健意识的逐渐增强，逐渐发现食品中的合成色素对人体具有潜在的危害，有些甚至能够致癌，已禁止使用。天然色素不但色泽自然，安全可靠，而且有些还具有一定的保健和药理作用，已越来越受到人们的关注［4］。植物色素多为花色苷类、黄酮类化合物、番茄红素类、胡萝卜素类，具有生物活性，可作为保健食品中的功能性有效成分［5］。而植物中提取的花色苷因其无毒害而被人们所关注，较多研究认为花色苷不但具有抗氧化、抗疲劳的作用，还具有较强的抗癌活性，具有抑制肿瘤增殖的作用［6］。肿瘤细胞的主要特征是具有无限的增殖能力，丧失了正常细胞的凋亡功能，以人肿瘤细胞进行体外细胞毒性实验已成为检测细胞毒性以及筛选抗肿瘤药物的主要的手段［7］，同时也能为判断植物提取物是否具有抗肿瘤的潜能提供最基础的数据［8］。稠李属的果实花色苷为天然植物提取物，具有抗氧化活性［9］，国内对稠李属植物的研究也多为生长特性及苗木繁育等方面［10-11］，而对稠李属果实花色苷对肿瘤增殖抑制的研究还未见报道。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

肝癌HepG2 细胞 哈医大肿瘤医院;小牛血清 杭州四季青;噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO) sigma 进口分装;改良型RPMI 1640 培养基 赛默飞世尔生物化学制品有限公司;胰蛋白酶 Sigma公司;双抗试剂(100U/mL 青霉素、100μg/mL链霉素) 北京索莱宝试剂公司。

DF-110 电子分析天平 中国轻工业机械总公司;GL-16G-C 高速冷冻离心机 上海科兴仪器有限公司;低温冰箱 FORMA 公司美国;SW-CJ-IC 超净工作台 中国苏州;酶标仪 Biocell 公司美国;CO2培养箱 Thermo Forma 公司;倒置显微镜 Nikon 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 花色苷的制备 分别取三种稠李果适量，剪枝、榨汁，同pH2 的酸化乙醇按照料液比1∶4(W∶V)混合，提取2 次，每次提取12h，合并提取液，旋转蒸发除去乙醇后，经X-5 大孔树脂上柱纯化，减压浓缩，真空冷冻干燥得到稠李属三种果实花色苷粉末，-20℃保存。实验时分别将三种果实花色苷用PBS缓冲液稀释到一定浓度，0.22μm 滤膜过膜备用［12］。

1.2.2 细胞培养液的配制 改良型RPMI 1640 基础培养基中，加入1% 的l00U/mL 青霉素，100μg/mL链霉，以及10%的灭活胎牛血清。

1.2.3 细胞的复苏与培养 从液氮中取出冻存的HepG2 细胞迅速放入37℃水浴1min，并不断摇动使其解冻。1000r/min 离心5min，吸弃上清液，培养于改良型RPMI 1640 培养基中加入l00U/mL 青霉素，100μg/mL 链霉素以及10%的灭活胎牛血清的培养液中。将细胞置于37℃，5% CO2培养箱中培养，HepG2 细胞在细胞培养瓶贴壁生长，每种培养液培养细胞均大于3 次，每3～4d 传代一次。

1.2.4 细胞生长抑制曲线 依据文献［13］方法并有所改动，将HepG2 以1.0 ×105个细胞/mL 的密度，每孔1mL，接种于96 孔培养板，放入37℃、5% CO2的细胞培养箱中，培养6h 待细胞贴壁生长良好后，加入不同质量浓度(0.05～1.2mg/mL)的花色苷培养，收集培养24、48、72h 的细胞，胎盘蓝染色，在3min 内，用血细胞计数板在普通光学显微镜下记数活细胞和死细胞。实验重复五次，并绘制细胞生长曲线。

1.2.5 MTT 法检测HepG2 细胞生长抑制率 参照文献［14］，取对数生长期的HepG2 细胞，经胰酶消化后，调整细胞密度为1 ×105个细胞/mL，接种于96 孔培养板，每孔100μL，将未经处理的细胞作为对照组，加入不同浓度花色苷的细胞作为处理组，只加花色苷和培养液而不含细胞的为空白组。其中处理组、对照组、处理组及空白组每个浓度各设3 个复孔。培养24、48、72h 后，每孔加入10μL MTT，继续培养4h，弃上清液，每孔加入150μL DMSO，利用酶标仪在490nm 测A 值，并计算细胞的生长抑制率。公式如下:

细胞生长抑制率(%)=［1-(处理组A 值-空白组A 值)/(对照组A 值-空白组A 值)］×100

以花色苷浓度为横轴，细胞抑制率为纵轴，绘制生长抑制曲线，并计算半数抑制浓度(median inhibitory concentration，IC50)。

1.3 数据分析

作图采用Origin8.0 软件，统计学处理实验数据采用SPSS 13.0 统计软件，One-Way ANOVA 进行处理和显著性分析检验，在p ＞0.05 水平上差异不显著;在p ＜0.05 水平上差异显著。

2 结果与分析

2.1 细胞生长抑制曲线结果

HepG2 细胞是高度分化的人肝癌细胞株，保存了很多正常人肝细胞的代谢特点，其生物学特性也与正常肝细胞相近，易于培养，比较稳定［15］，所以本实验使用HepG2 细胞作为受试细胞。在实验中，胎盘蓝将死细胞被染为蓝色，而活细胞拒染。

2.1.1 紫叶稠李果花色苷对HpG2 细胞生长曲线的影响 紫叶稠李的不同浓度花色苷作用人肝癌HepG2 细胞24h 后，各组的活细胞数量产生差异，并且随着时间的延长各组的活细胞数目差异逐渐增大，与时间呈依赖性效应关系。由图1 可知，0.4、0.8、1.2mg/mL 处理组活细胞数量与对照组相比显著减少，显示出细胞大量死亡;而0.1、0.2mg/mL 处理组虽较对照组生长缓慢，但活细胞依然呈现增长的状态，与对照组相比抑制细胞的增殖程度并不大;从图中还可以看出0.05mg/mL 处理组活细胞数量递增，且在24、48、72h 均大于对照组活细胞数，提示0.05mg/mL 的紫叶稠李果实花色苷对HepG2 细胞具有一定的增殖作用。

图1 紫叶稠李果花色苷对HpG2 细胞生长曲线的影响Fig.1 The effect of anthocyanin extracted from Padus Virginiana on the proliferation curve of HepG2 cell

2.1.2 山桃稠李果花色苷对HpG2 细胞生长曲线的影响 由图2 可知，在山桃稠李的不同浓度花色苷作用人肝癌HepG2 细胞24h 后，各处理组细胞增殖均低于对照组，呈现出浓度依赖性和时间依赖性效应关系。质量浓度大于0.2mg/mL 处理组与对照组相比具有显著性差异，能够显著降低HepG2 细胞活力，但0.05、0.1mg/mL 对活细胞的作用依然较低，表明0.1mg/mL 以下浓度的山桃稠李花色苷虽能抑制HepG2 细胞快速增殖，但细胞增殖率降低程度不大。

图2 山桃稠李果花色苷对HpG2 细胞生长曲线的影响Fig.2 The effect of anthocyanin extracted from Prunus maackii on the proliferation curve of HepG2 cell

2.1.3 稠李果花色苷对HpG2 细胞生长曲线的影响

由图3 可知，稠李的不同浓度花色苷作用人肝癌HepG2 细胞24h 后，各处理组细胞增殖均低于对照组，与对照组相比，活细胞数量花色苷浓度的增大以及时间的延长呈下降的趋势。质量浓度大于0.1mg/mL 的处理组对HpG2 细胞生长抑制显著，而质量浓度为0.05mg/mL 的处理组，对细胞增殖抑制相对较低。

图3 稠李果花色苷对HpG2 细胞生长曲线的影响Fig.3 The effect of anthocyanin extracted from Padus racemosa on the proliferation curve of HepG2 cell

肿瘤细胞生长的显著特点是快速增殖且不受控制，但当细胞所处的环境发生改变时，细胞形态也会发生的相应变化甚至引起细胞凋亡［16］。本实验探讨不同浓度的花色苷作用于人肝癌HepG2 细胞24、48、72h 后，胎盘蓝染色，在倒置显微镜下观察并计数，发现相对高的浓度(0.1～1.2mg/mL)的三种果实花色苷均能抑制细胞生长，而低浓度(0.05mg/mL)的紫叶稠李果花色苷能够促进细胞生长。而本实验探讨的是三种果实花色苷对HepG2 细胞的增殖抑制作用，由此实验结果，下述实验去除质量浓度为0.05mg/mL 的处理组。

2.2 MTT 法检测花色苷对HepG2 细胞生长抑制率

四甲基偶氮唑盐比色法(MTT 法)的原理是在活细胞内的线粒体琥珀酸脱氢酶可将MTT 还原成蓝紫色甲瓒，而其形成的量与活细胞数量成正比关系。该法已被应用于细胞系的体外抗癌药物筛选，由于MTT 是比色测定，故花色苷本身的颜色也会干扰结果的准确性［17］，所以必须排除花色苷本身的颜色对MTT 实验结果的干扰。

2.2.1 紫叶稠李果实花色苷对HepG2 细胞生长抑制率 紫叶稠李果实花色苷分别作用HepG2 细胞后，结果如表1 所示。随着花色苷浓度的升高，以及作用时间的延长，对HepG2 细胞增殖的抑制作用都逐渐增强，表现出明显的剂量效应和时间效应。与对照组(未经处理的细胞)相比差异性显著(p ＜0.05)，表明紫叶稠李花色苷能抑制HepG2 细胞生长增殖，降低细胞活性。并且当质量浓度为1.2mg/mL 紫叶稠李果实花色苷处理HepG2 细胞24、48、72h 后，抑制率分别为(40.97 ± 4.92)%、(52.76 ± 3.36)%、(57.22 ±2.29)%。

表1 MTT 法检测紫叶稠李果实花色苷对HepG2 细胞抑制率Table 1 Inhibition of the anthocyanin extracted from Padus Virginiana on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2.2 山桃稠李果实花色苷对HepG2 细胞生长抑制率 山桃稠李果实花色苷分别作用HepG2 细胞后，结果如表2 所示。随着花色苷浓度的升高，以及作用时间的延长，对HepG2 细胞增殖的抑制作用都逐渐增强，并称浓度依赖与时间依赖。与对照组(未经处理的细胞)相比差异性显著(p ＜0.05)，并且在同一时间点各浓度之间，同一浓度各时间点之间，山桃稠李果实花色苷对HepG2 细胞的抑制率均有显著差异(p ＜0.05)。当质量浓度为1.2mg/mL 山桃稠李果实花色苷处理HepG2 细胞24、48、72h 后，抑制率分别为(45.77 ± 3.68)%、(58.23 ± 2.21)%、(61.19 ±4.65)%，抑制率均大于紫叶稠李。

表2 MTT 法检测山桃稠李果实花色苷对HepG2 细胞抑制率Table 2 Inhibition of the anthocyanin extracted from Prunus maackii on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2.3 稠李果实花色苷对HepG2 细胞生长抑制率 稠李果实花色苷分别作用HepG2 细胞后，结果如表3 所示。在0.1～1.2mg/mL 浓度范围内，随着花色苷浓度的增加，其抑制率逐渐增大。且随着时间的延长，抑制率也逐渐升高。抑制规律与前两种花色苷一样，在同一时间点各浓度之间，同一浓度各时间点之间，稠李果实花色苷对HepG2 细胞的抑制率均有显著差异(p ＜0.05)。当质量浓度为1.2mg/mL稠李果实花色苷处理HepG2 细胞24、48、72h 后，抑制率分别为(47.73 ± 1.67)%、(67.92 ± 2.78)%、(78.82 ± 4.13)%，抑制率均大于紫叶稠李、山桃稠李。

表3 MTT 法检测稠李果实花色苷对HepG2 细胞抑制率Table 3 Inhibition of the anthocyanin extracted from Padus racemosa on the proliferation of HepG2 cell tested by MIT

2.2.4 稠李属三种果实花色苷对HepG2 细胞增殖抑制作用比较 选取在质量浓度为0.1～1.2mg/mL 范围的三种果实花色苷分别作用HepG2 细胞48h 后的结果作图，由图4 所示，随着三种果实花色苷浓度的升高对HepG2 细胞的增殖抑制作用都逐渐增强，表现出明显的剂量效应关系。通过计算得到的紫叶稠李、山桃稠李、以及稠李的IC50值分别为:1.07、0.82、0.64mg/mL。并且，在质量浓度小于0.4mg/mL 时稠李、山桃稠两种果实花色苷对HepG2 细胞抑制率高于紫叶稠李，差异显著(p ＜0.05)，而稠李、山桃稠李差异不显著(p ＞0.05)。在质量浓度大于0.4mg/mL时稠李果实花色苷对HepG2 细胞抑制率明显高于山桃稠李，且稠李属的三种果实花色苷均差异显著(p ＜0.05)。

图4 三种果实花色苷对HepG2 细胞生长抑制率对比Fig.4 The inhibition of three kinds of anthocyanins effect on the proliferation of HepG2 cell

3 结论与讨论

抑制癌细胞增殖被认为是药物具备抗癌效果的一个主要标准，而药物对恶性肿瘤细胞的毒作用又通常与它们抑制细胞增殖的能力有关，所以通过药物对细胞的毒性检测对评估一种天然产物是否具有抗癌潜能有重要意义［18］。

通过对本实验的研究有如下分析:

3.1 由图1～图3 显示三种果实花色苷对HepG2 细胞的生长都具有一定的影响。0.05mg/mL 的紫叶稠李果实花色苷能够促进HepG2 细胞的生长，其原因可能是紫叶稠李花色苷在低浓度时作为HepG2 细胞的营养物质，而当浓度提高到0.1mg/mL 才能够对HepG2 细胞的增殖产生影响。

3.2 通过胎盘蓝染色法和MTT 方法研究发现，0.1～1.2mg/mL 的花色苷处理HepG2 细胞24、48、72h 后，稠李属三种果实花色苷对HepG2 细胞均具有较强的细胞毒性，且与浓度和时间具有依赖性。三种果实花色苷对HepG2 细胞生长抑制率的大小为:稠李＞山桃稠李＞紫叶稠李。说明HepG2 细胞对稠李属的三种果实花色苷均比较敏感。

上述结果表明紫叶稠李、山桃稠李、稠李对HepG2 细胞具有潜在抗癌活性，可能与其改变细胞的抗氧化活性系统、诱导细胞凋亡、抗血管生成等活性有关［19-20］，机制尚不明确，有待进一步的研究。

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