牛初乳免疫球蛋白IgG微胶囊的制备及其释放性能

王璐怡，李云飞,2,*，刘临洁，肖 菲

(1.上海交通大学农业与生物学院食品科学与工程系，上海 200240；2.上海交通大学陆伯勋食品安全研究中心，上海 200240)

牛初乳含有大量的免疫因子，具有多种生物活性。其中免疫球蛋白(immunoglobulin G，IgG)在免疫和生理调节过程中起着重要作用，是免疫系统中最为关键的物质之一，已成为功能性食品添加剂的研发热点[1-3]。然而IgG易受外界不良环境因素影响而变性降解，因此提高IgG的稳定性对于有效发挥其生理活性显得尤为重要[4]。

微胶囊技术已被广泛应用于医药、食品、化妆品、农药等多个领域。通过微胶囊化能保护敏感物质免于不良反应，显著提高产品的稳定性和货架期，有效控制芯材释放，并扩大芯材的使用范围[5-6]。食品微胶囊的制备方法很多，其中乳化/喷雾法具有制备条件温和、操作简便、包埋率高等特点，在不稳定活性蛋白微胶囊化的大规模生产方面极具潜力[7-8]。

采用微胶囊技术包埋免疫球蛋白能增加其对外界环境的抵抗力，提高其到达肠道的生理活性[9-10]，但传统的微胶囊在制备过程中常加入有机溶剂。为了得到性能良好且安全无毒的微胶囊，本实验以大豆油作为油溶性介质[11]，选择具有良好乳化性质的阿拉伯胶(arabic gum，GA)和麦芽糊精(maltodextrin，MG)作为复合壁材和稳定剂[12-13]，研究IgG微胶囊乳化-喷雾法制备工艺、理化性质及体外释放性能。在提高IgG稳定性的同时，也为延长相应产品的贮藏期提供了新思路。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牛初乳乳清：初乳由光明乳业集团奶牛场提供，均为母牛产犊后7d内产的初乳，原料经均质、脱脂、灭菌后冷冻保存，每次实验取同一批次初乳，二次均质并去酪蛋白后得到乳清；福临门一级大豆油 中粮食品营销有限公司。

阿拉伯胶、麦芽糊精、胃蛋白酶、胰蛋白酶(均为分析纯) 国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

88-1型定时恒温磁力搅拌器 上海司乐仪器有限公司；APV 1000均质机 丹麦APV有限公司；JY92-IID超声波细胞粉碎仪 上海比朗仪器有限公司；GPW 120-Ⅱ型微型喷雾干燥机 山东天力干燥设备有限公司；EQUINOX 55傅里叶红外光谱分析仪 德国布鲁克光谱仪器公司；Nano 230型低真空超高分辨场发射扫描电子显微镜 美国FEI公司。

1.3 方法

1.3.1 IgG微胶囊的制备

将Span-85按比例溶解于大豆油中，制成油相。在乳清溶液中加入麦芽糊精与阿拉伯胶以及适量吐温-60，均质后制成水相。按一定的油水体积比将水相边搅拌边滴加到油相中，进行初步乳化后于细胞粉碎仪上超声12次(8s/次，间歇5s)制成乳状液[14-15]，随后进行喷雾干燥，速率设定为15mL/min。将喷雾干燥制得的样品装袋、密封并置于冰柜中贮存待用。

1.3.2 包埋率测定

取0.5 g 微胶囊溶于1 0 m L 磷酸盐缓冲溶液(内含0.01g/100mL酯酶、0.5g/100mL胆碱)中，振荡混匀，于37℃放置2h后取样测定溶液中IgG的含量，用式(1)计算IgG包埋率[16]。

1.3.3 单因素试验设计

在喷雾干燥进风温度130℃、GA与MD总添加量为5%，且两者质量比1：1的条件下，考察不同油水体积比对微胶囊化效果的影响。

在喷雾干燥进风温度130℃、油水体积比3：4、GA与MD总添加量5%的条件下，考察两种壁材不同质量配比对微胶囊化效果的影响。

在喷雾干燥进风温度130℃、油水体积比3：4、GA与MD质量比1：2的条件下，考察不同GA与MD添加量对微胶囊化效果的影响。

在油水体积比3：4、GA与MD总添加量为4%，且两者质量比为1：2的条件下，考察不同干燥进风温度对微胶囊化效果的影响。

1.3.4 乳化条件及喷雾干燥工艺的确定

通过的单因素试验，选择体系油水体积比、壁材配比(阿拉伯胶与麦芽糊精)、壁材添加量及进风温度4个考核因素，研究其对IgG包埋率的影响。为获得最佳微胶囊化条件，设计L9(34)正交试验。

1.3.5 微胶囊表面形态的观察

将适量最佳条件下制备得到的微胶囊样品均匀黏附于导电胶上，表面喷金后，用扫描电镜(scanning electron microscopy，SEM)，加速电压500kV，观察其形貌特征。

1.3.6 微胶囊结构的表征

采用K B r 压片的方法对微胶囊进行红外光谱分析。红外光谱分析条件为：透射模式，扫描波数4000～400cm-1。

1.3.7 微胶囊体外释放性能的测定

将微胶囊样品分别置于不同的释放介质中，(37±0.2)℃恒温水浴，在转速为100r/min的条件下定时取样0.5mL，并立即补充等量等温介质。由式(2)求得各时间点的累积释放率[17]。实验中3种不同的释放体系分别为：含1g/100mL胃蛋白酶的盐酸溶液，pH2.0的模拟胃液(SGF)、含1g/100mL胰蛋白酶的磷酸缓冲液，pH6.8的模拟肠液(SIF)以及pH7.4的磷酸盐溶液。

式中：ρn为第n个时间点所取样品中IgG质量浓度/(mg/mL)；V为释放介质总体积/mL；Vi为第i个时间点的取样体积/mL；ρi为第i个时间点所取样品中IgG质量浓度/(mg/mL)；m为微胶囊样品中总IgG质量/mg。

1.3.7 统计学分析

2 结果与分析

2.1 微胶囊制备的单因素试验结果

表1 微胶囊单因素试验结果Table 1 Scheme and results of single factor design in the preparation of microencapsulation

由表1可知，当油水体积比为7：10～4：5时包埋效果较好。究其原因可能是当油相含量过高时，壁材容易黏聚反而不利于包埋，从而使包埋率降低；当水相含量过高时，油相不能完全包埋水相，同样不利于包埋。

当GA与MD的质量比为1：1～1：2时包埋效果较好。究其原因可能是当GA比例过高时，易造成料液黏度过大，不利于水相分子与油相分子间的充分分散和接触，导致离心喷雾时雾滴难以形成，从而降低包埋率。而MD成膜性差，若比例过高，形成的胶囊囊壁疏松，也会降低包埋率。

GA与MD添加量为4%～6%时包埋效果较好。但当添加量为6%时，乳状液的黏度达到62.59mPa·s(25℃)，不利于乳状液进料和喷雾，且添加量为3%或4%时，包埋率没有显著性差异(P＞0.05)。此外，由于GA价格较高，所以在保持较高包埋率的基础上，选择尽可能低的壁材含量。因此，将选择两者添加量为3%～5%进行下一步优化实验。

进风温度为120～140℃时微胶囊化效果较好。究其原因可能是较高的进风温度有利于雾化后的液滴快速形成表面致密结构，有利于芯材的保留。此外，进风温度过低(110℃)时产品含水率高，流动性不好，易黏壁，包埋效果不好，不利于收集；进风温度过高(150℃)时，水分散失速度过快，影响产品的包埋效果，并且在高温下芯材易失活。

2.2 微胶囊制备的正交试验

正交试验设计方案及试验结果如表2所示，试验结果的方差分析如表3所示。

表2 微胶囊制备正交试验设计方案及结果Table 2 Scheme and results of orthogonal design in the preparation of microencapsulation

由表2可知，极差R由大到小的顺序是C＞D＞A＞B，表明影响微胶囊包埋率的主要因素是壁材添加量，其次是进风温度，然后是油水体积比，壁材的质量配比对微胶囊化效果影响较小，筛选水平组合为A2B1C3D3。壁材添加量反映了乳状液中的固形物含量，是影响包埋率的重要因素。此外，随着油水体积比的增大，微胶囊的包埋率先增大后减小，表明体系内水相体积偏大或偏小都会影响包埋率。而随着mGA：mMD质量比的减小，微胶囊的包埋率先减小后增大，通过方差分析可知，当GA与MD质量比为1：1或1：2时，包埋率没有显著性差异(P＞0.05)，从经济角度考虑，选择比例1：2，即选择组合为：A2B3C3D3。由表3可知，微胶囊的包埋率随着壁材添加量以及进风温度的增加均呈现增大趋势。

表3 正交试验设计结果的方差分析Table 3 Variance analysis of test results of orthogonal design

综合上述结果，选择最佳因素水平组合：A2B3C3D3，即在油水体积比3：4、GA与MD的质量比为1：2、壁材添加量为5%、进风温度140℃的条件下进行验证实验。实验结果表明在该条件下，微胶囊的包埋率达到(81.24±1.33)%。

2.3 最优条件下制备的微胶囊的形貌特征

图 1 IgG微胶囊的扫描电镜图Fig.1 SEM micrographs of IgG microcapsules

微胶囊颗粒的空隙及表面完整性影响着芯材的释放，且颗粒外部表面形态与微胶囊产品的流动性密切相关，因此对微胶囊产品形态特征的研究显得尤为重要[18]。由图1可知，微胶囊外观整体为球形，表面较为光滑致密，粒径大小介于1～5μm。微胶囊颗粒表面有典型的褶皱以及凹陷，但并无空洞和破裂现象。壁材结构具有较好的完整性和致密性，表明其对芯材具有良好的保护效果。当体系含有蛋白质分子时，干燥过程中雾化液滴表面的失水收缩与蛋白质分子的脱水紧密相关，因此微胶囊表面的凹陷主要是由于液滴不同部位的干燥速率差异以及蛋白脱水收缩等因素造成的应力不均所致[19]。此外，扫描预处理时的真空环境以及高温处理导致胶囊表面部分水分蒸发，进而发生表面凹陷现象。有研究表明囊壁的凹陷可能与壁材中含有的碳水化合物含量较高有关[20]。微胶囊表面凹陷的存在不利于粉末的流动性与稳定性[21]，但对产品的包埋率及产品特性无明显的影响。

2.4 微胶囊的红外光谱

图 2 IgG的红外光谱Fig.2 FT-IR spectrum of IgG

图 3 微胶囊化IgG的红外光谱Fig.3 FT-IR spectrum of microencapsulated IgG

红外光谱法已广泛应用于蛋白质的二级结构研究[22]。由图2～3可知，牛初乳免疫球蛋白IgG的红外特征峰主要是氨基及羰基的伸缩振动、氨基的弯曲振动以及某些混合振动所引起的吸收。酰胺Ⅰ带的吸收区间为1700～1600cm-1，主要是氨基酸的—C=O伸缩振动、N—H变形振动和C—N伸缩振动的偶合，对二级结构的变化非常敏感。酰胺Ⅱ带的吸收区间为1600～1500cm-1，主要是C—N的伸缩振动和N—H的变形振动，对二级结构变化的敏感度仅次于酰胺Ⅰ带，主要揭示蛋白质或多肽与周围介质的氢键缔合情况。酰胺III带的吸收区间为1325～1225cm-1，在一定程度上也能直观反映蛋白质二级结构的变化。IgG酰胺I带、Ⅱ带、Ⅲ带的振动频率分别为1634.75、1539.85cm-1和1237.42cm-1，这与文献[23]报道相符。当微胶囊化后，IgG的3个酰胺带分别移动至1646.44、1537.68cm-1和1240.03cm-1，谱带峰形与相对强度也发生了变化。其中，酰胺Ⅱ带发生的蓝移现象与Leslie等[24]研究结果一致，即蛋白质分子经脱水作用后，酰胺Ⅱ带的吸收向短波数方向移动。谱带的变化说明碳水化合物与蛋白在微胶囊形成过程中可能存在氢键缔合作用，减少了干燥脱水引起的界面膜或壁结构的不均匀收缩，有利于IgG的包埋效果。同时，IgG微胶囊化后，所有的特征峰均存在，说明基本保持了芯材IgG原有的结构及营养价值。

2.5 微胶囊体外释放动力学的研究

将IgG的动力释放过程分别用零级释放模型、一级释放模型、Higuchi模型和Peppas模型进行拟合，结果见表4。

表4 微胶囊释放模型的拟合结果及相关系数Table 4 Model fitting results and correlation coefficients for the release of microcapsuled IgG

由表4可知，在PBS溶液中，零级动力学模型最接近微胶囊的释放行为；而在模拟肠液和模拟胃液两种释放介质中，微胶囊的最佳拟合模型皆为一级动力学模型，说明IgG微胶囊的释放主要是由于囊壁被蛋白酶消化和降解，因而释放速度较快。符合Vueba的研究结果，即当微球中药物的释放是由扩散作用和微球的降解作用同时控制时，一级释放动力学模型要比Higuchi模型更好地模拟药物的释放行为[25]。Peppas模型是将药物释放的扩散项与骨架溶蚀项相加得到的一个半经验指数方程[26]。其中n是表征释放机制的特征参数，当n≤0.45时，释放机制为Fick扩散(Fick Diffusion)；当0.45＜n＜0.89时，药物释放为Non-Fick扩散，释放机制为扩散和骨架溶蚀二者的协同作用(即溶蚀-溶散-扩散协同作用)；当n≥0.89时，释放机制为骨架溶蚀。在本实验3种不同的释放介质中，微胶囊Peppas模型的释放参数n均在0.45～0.89范围内，说明微胶囊的释放机制为扩散和骨架溶蚀的共同作用。

3 结 论

通过正交试验确定了IgG微胶囊的最佳工艺：油水体积比为3：4，GA与MD的质量比为1：2且添加量为5%，进风温度为140℃。在此条件下制备得到微胶囊产品的包埋率为81.24%。扫描电子显微镜结果显示微胶囊外观整体为球形，表面较为光滑致密，粒径大小在1～5μm，表明其对芯材具有良好的保护效果。

红外光谱检测结果表明，IgG酰胺Ⅰ带、Ⅱ带、Ⅲ带的振动频率分别为1634.75、1539.85、1237.42cm-1。当微胶囊化后，IgG的3个酰胺带分别移动至1646.44、1537.68、1240.03cm-1，表面碳水化合物与蛋白在微胶囊形成过程中可能存在氢键缔合作用，有利于提高IgG的包埋效果。同时，IgG微胶囊化后，所有的特征峰均存在，说明基本保持了芯材原有的结构及营养价值。

微胶囊的释放模型拟合结果表明，在PBS溶液中，零级动力学模型最接近微胶囊的释放行为；而在模拟肠液和模拟胃液两种释放介质中，微胶囊的最佳拟合模型皆为一级动力学模型。微胶囊的释放机制为扩散和骨架溶蚀的共同作用。

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