3种医院中药制剂微生物限度检查方法

贲彦鸿,曹东东

(1.广州市黄埔区食品药品检验所,广州510700;2.吉林华康药业股份有限公司,吉林敦化133799)

医院中药制剂多是由几味药材组成的复方制剂,其中有些药材具有清热、解毒、利咽、祛火等功效。这些药材存在一定抑菌活性,在做药品的微生物限度检查时,这些有抑菌活性的药材可能会抑制药品中污染的微生物,从而不能反映药品的真实污染情况,为临床用药带来风险。因此,对含抑菌类成分的制剂采用适当的方法,消除其抑菌作用达到真实准确的反映药品质量十分必要。本文按2010年版《中国药典》[1]要求,对金钱草合剂等3种医院中药制剂建立了相应的微生物限度检查方法,并进行检查方法的验证,确立了各制剂可行的微生物限度检查法,为医院中药制剂的临床用药提供科学依据。

1 材料

1.1 仪器 HTY-2000集菌仪(杭1州泰林医疗器械有限公司);HTY-FC50一次性使用薄膜过滤器(杭州高德医疗器械有限公司);JJ1000电子天平(常熟市双杰测试仪器厂);CL-32LALP自动蒸汽灭菌器(Co.LtdTokyoJapan);GHP-9160隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);MJ-150FI霉菌培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)

1.2 菌种 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001],黑曲霉[CMCC(F)9003],均由中国药品生物制品检定所提供,均为第3代菌种。

1.3 培养基 pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液(批号：1008122)、营养琼脂培养基(批号：100826)、玫瑰红钠琼脂培养基(批号：100909)、营养肉汤培养基(批号：100625)、改良马丁培养基(批号：100622),均为北京三药科技开发公司生产,经培养基适用性检查均符合规定。

1.4 供试品 广金钱草合剂(批号120808,120929,121009);急性咽炎合剂(批号120810,120927,121020);慢性咽炎合剂(批号120727,120814,121018)均由广州市黄埔区中医院药剂科提供。

2 方法与结果

2.1 菌液的制备 分别接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中,置35℃培养24 h;接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中,置25℃培养48 h,用0.9%无菌氯化钠溶液制成50～100 cfu/mL菌数的菌悬液,备用。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁培养基中,置28℃培养 7 d,加入的 3～5 mL含0.05%聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液,洗脱孢子,吸出孢子悬液至无菌试管中,用0.9%无菌氯化钠溶液制成50～100 cfu/mL的孢子悬液,备用。

2.2 供试液的制备 分别取原液10mL,加入pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液90 mL中,摇匀,作为1∶10供试液,备用。

2.3 验证方法

2.3.1 试验组 1)常规法分别取供试液和上述制备的菌悬液各1 mL,注入无菌平皿中,立即倾注琼脂培养基,摇匀,待凝固后倒置于培养箱,于规定温度时间培养(细菌30～35℃培养3 d,霉菌、酵母菌 23～28℃培养5 d),计数。每株试验菌平行制备2个平皿。2)培养基稀释法：方法同常规法,供试液为0.2 mL/皿。3)薄膜过滤法：取供试液 1 mL加入100 mL pH 7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液中,摇匀,过膜,用缓冲液400 mL分次冲洗滤膜,在最后1次冲洗液中加入菌悬液1 mL,取出滤膜,贴于琼脂平板上,培养,计数。

2.3.2 菌液组 取备用菌液1 mL,按菌落计数法测定菌数。

2.3.3 供试品对照组 取供试液1 mL,按菌落计数法测定菌数。

2.3.4 回收率计算 回收率(%)=(试验组菌数-供试品组菌数)/菌液组菌数×100%

2.4 结果

2.4.1 常规法 测定回收率结果见表1。表1表明,广金钱草合剂对各菌种的回收率均在70%以上,证明无抑菌作用或抑菌作用很弱,可用常规法检查;急性咽炎合剂和慢性咽炎合剂对霉菌无抑菌作用或抑菌作用很弱,可用常规法检查霉菌和酵母菌计数;对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率均在70%以下,表明2种制剂对细菌均有一定的抑制作用。

2.4.2 培养基稀释法 测定回收率结果见表2。表2表明,采用0.2 mL/皿供试液的培养基稀释法,急性咽炎合剂对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌回收率均高于70%,可用培养基稀释法检查。慢性咽炎合剂对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率仍低于70%,表明该药对2种细菌仍有抑制作用。

2.4.3 薄膜过滤法 测定回收率结果表明,慢性咽炎合剂对大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率分别为94.8%、90.5%和91.6%,对3种试验菌的回收率均达90%以上,该方法可用于该制剂的微生物限度检查。

表1 常规法测定各菌种回收率

表2 培养基稀释法测定各菌种回收率

2.5 微生物限度检查方法确立

2.5.1 细菌计数法 验证试验表明,对有抑菌作用的供试品,相应采用培养基稀释法和薄膜过滤法处理,能使被抑制的大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌的回收率达到规定要求。按照上述方法,在检查前对样品进行相应的处理,并进行3次独立平行的验证试验,结果显示,各验证菌菌种的回收率均高于70%,表明试验所采用的细菌计数方法成立。

2.5.2 霉菌和酵母菌计数法 验证试验表明,白色念珠菌和黑曲霉菌的回收率均高于70%,霉菌和酵母菌计数法可采用常规法进行检查。

3 讨论

医院中药制剂作为医院临床用药的一部分,已成为医院药学的重要组成部分[2]。因此,对于医院制剂进行质量控制,确立合理的标准成为确保医院中药制剂质量的前提。微生物限度检查是中药制剂检验标准的一项必检项目,寻找可靠、简单、快捷的微生物限度检查方法,通过方法验证,确立各医院中药制剂切实可行的微生物限度检查方法是中药制剂检验的一项重要内容,也为临床用药提供重要保障。本文按照2010年版《中国药典》要求,对3种医院中药制剂的微生物限度检查方法进行确立。

实验表明,广金钱草合剂对5种试验菌的回收率均高于70%,证明该药无抑菌作用,可通过采用常规法进行微生物限度检查;急性咽炎合剂有一定程度的抑菌作用,但可通过培养基稀释法消除抑菌作用;慢性咽炎合剂有较强的抑菌作用,用培养基稀释法仍不能完全消除其抑菌作用,选择薄膜过滤法将含有的抑菌成分过滤消除,使该制剂对5种试验菌的回收率均达到70%以上。该方法可行有效,也为临床应用医院中药制剂提供了科学依据。

[1]国家药典委员会.中国药典[M].北京：化学工业出版社,2010.

[2]李晓东,李娟,郭朝晖,等.几种医院外用中药制剂微生物限度检查方法的建立[J].西部中医药,2012,25(2)：25-27.

[3]潘雯,关倩明,林玲.7种具有抑菌成分中成药的微生物限度检查方法验证[J].广东药学院学报,2012,28(6)：623-627.

[4]张庆启.医院药房中草药的科学储藏与保管[J].长春中医药大学学报,2012,28(3)：554.