羊水干细胞对梗死心肌的修复作用

何凌宇，项 军，梅 健，王 岩，王 磊，刘 成，薛 松

心肌发生缺血性梗死后，心肌细胞随之出现坏死、凋亡等病理改变，造成有效细胞数目减少，由于成熟的心肌细胞本身已不再具有再生修复的能力，那么损伤及坏死的心肌细胞逐渐形成了纤维瘢痕，这样的心室重塑只有导致有效的心室功能下降的趋势，促使心力衰竭尽快发生［1］。近年随着科技的进步，在心血管修复的再生治疗学领域里有了突破性进展，心肌细胞成形术(cellular cardiomyoplasty，CCM)可以通过干细胞、祖细胞或心肌细胞移植，或者通过动员外周血或骨髓干细胞，重植于心肌损伤的部位，从而对梗死心肌进行再生修复［2－3］。CCM 成为有可能逆转心肌梗死后恶化的血流动力学和神经内分泌的利器。各种动物实验都证明了干细胞具有可再生心肌细胞、改善梗死心肌的血液灌注和心脏功能的生物学效应［4］。

目前，CCM 应用于临床的主要有胚胎干细胞(ESCs)、骨髓来源的干细胞/祖细胞、脂肪组织来源的多潜能干细胞、宿主心肌干细胞(resident cardiac stem cells，CSCs)和间充质干细胞群 (Mesenchymal stem cells，MSCs)。而羊水干细胞(Amniotic fluid stem cell，AFS)由于组织来源广泛、分离纯化方法简单易行、体外培养具有较强的增殖能力和多向分化潜能等优点，正逐渐被人们所认识，使其作为细胞心肌移植的良好供体，显示出其巨大的潜力。

1 羊水来源干细胞是可靠的修复细胞来源

羊水中细胞成分众多，目前对于这些细胞的起源了解有限，羊水中除有胎儿的表皮细胞、呼吸道上皮细胞、消化道和泌尿道等体腔管道的脱落细胞外，还含有来源于羊膜组织和3个胚层的细胞［5］。对孕期在7 ～12 周的羊水细胞组成分析，发现羊水中含有可能来源于胚胎卵黄囊的造血祖细胞，也是组织修复细胞之一。

Kocher 等［6］对人羊水细胞进行了分析，结合Kazuki 等［7］在人和鼠的AFS 中研究结果，分离出羊水中表达Esc 和Asc 表面标志的细胞，并以此估计AFS 数量上约占羊水细胞总数的1%。他们认为这种干细胞多潜能性介于胚胎干细胞与成体干细胞之间。

2 AFS 生物学特性

2.1 AFS 的标志性抗原 目前尚未发现人AFS 所特有的表面标志性抗原，但对人AFS 的表面标志的鉴定，基本取得了共识，AFS 表面表达CD29、CD44、CD105、CD73 黏附因子和间充质的标志，不表达CD34、CD45 等造血干祖细胞标志及内皮标志Cn31，胚胎性抗原中SSEA－4、Oet－4 阳性，而SSEA －3、Tra－l－61、Tra －l －80 为阴性。人类白细胞抗原HLA －DR 阴性，而Ⅰ类白细胞抗原HLA－A、B、C 阳性。但是各个研究组对这些标志性抗原所测定的数量差异较大，造成这种现象的原因可能是缺乏统一的AFS 的纯化标准以及检测方法的差异性等各个方面造成，同时这也表明羊水中可能存在表达抗原差异的干细胞群的存在［8］。

特别是Oct－4、Nanog、SSEA －4 等胚胎特异性标志抗原的表达，Oct－4、Nanog 是维持干细胞分化潜能的主要转录因子，干细胞分化后该基因的表达马上下调或消失，这在最近对再生修复基因重组方面的研究中得到明确。特异性抗原SsEA－3/ssEA－4 抗原来自小鼠移植前胚胎及人类胚胎细胞，而且这些表达仅限于移植前的胚胎细胞表面［9］。因此可以说明，AFS 可能来源于非常原始的细胞群落，比成体干细胞具有更广泛的自我更新和多种系分化的能力。

2.2 AFS 的多向分化能力 2011 年Li 等［10］最早报道了从人孕早期羊水中分离并扩增的干细胞，于体外将其诱导为脂肪样细胞及成骨样细胞，随后AFS 向神经元、软骨细胞、心肌细胞、内皮细胞、平滑肌细胞、肝细胞等诱导的报道不断出现，诱导体系与其他来源的间充质干细胞相似度较高。Muller等［11］从孕4 ～6 个月人的羊水中分离培养获得的多能间充质干细胞，在诱导因子作用下能够向多种细胞分化，这些包含了:使用地塞米松、胰岛素等诱导其分化为脂肪细胞;使用地塞米松、维生素C－2 －磷酸盐可以诱导其分化为成骨细胞;成纤维细胞生长因子和p －琉基乙醇等诱导其分化为神经系细胞，之后并证实了分化后的神经系细胞能够分泌释放多巴胺。Zhao等［12］对羊水成纤维细胞型细胞进行培养，于第3 代获得与BMSCs 相似，形态学上同源于成纤维细胞样的细胞群。

在适当的培养条件下，AFS 分化至第8 代可分化为脂肪细胞、骨细胞、多形态软骨细胞和神经元;第5 ～21 代，由于细胞端粒酶活性水平的不断降低，成骨蛋白、甲胎蛋白、Nestin和肝细胞核因子在体外扩增时显示出差异性表达是比较明显的。有关AFS 的分化潜能，有几个值得注意的现象。国内学者马晓荣等［13］发现人羊水来源干细胞以类胚体样结构形式向心肌样细胞分化的可行性，为AFS 在再生医学的研究做出了较大贡献。

3 AFS 在组织工程学的广泛应用

羊水来源的干细胞为组织工程提供了一个新的种子细胞来源。Orlic 等［14］将体外培养获得的羊水细胞处理后，种植于可降解的生物材料PGA 支架上，发现随着细胞不断生长，密集度的增加，逐渐能填满PGA 纤维孔隙。羊水来源的胎羊间充质干细胞也被成功地应用于构建组织工程，隔肌进而修复新生的隔肌，并取得了良好的效果。Wang 等［15］将AFS 处理后嵌入藻酸盐做支架的工程上，此细胞/支架结构在骨原性诱导培养基中，培养后植入免疫缺陷鼠皮下后成功形成组织工程骨组织。AFS 在医学多学科再生方向中取得了长足进展。

2010 年Valli 等［16］研究中将羊水来源间充质干细胞，处理后能够移植入正常鼠大脑的多个区域并长期保持存活，而且发现在注入脑缺血的模型鼠的脑缺血区外围时具有向损伤区域分化、迁移的能力。AFS 分化后的细胞也能够表现出特定的再生功能，神经元可分泌各种神经递质样物质，分化的肝细胞可产生尿素样物质，将标记绿色荧光蛋白的AFS 通过显微注射技术注射到孕12d 左右小鼠胚胎肾脏皮质内，通过活体显微观察，原为杂交等技术证实注射的AFS 可整合到原始肾脏细胞群体中并进一步分化、生长［17－22］。

4 展望

干细胞研究是21 世纪再生医学的研究热点之一，AFS 可为组织工程学研究提供新的种子细胞来源，随着深入研究AFS的分化机制及实验方向的开展，建立和完善AFS 的体外培养体系，对梗死心肌的再生医学研究具有重大意义。

1 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al． Bone Marrow cells regenerate infracted myocardium ［J］． Nature，2001，410:701 －705．

2 Zhang S，Geng H，Xie H，et al． The heterogeneity of cell subtypes from a primary culture of human amniotic fluid ［J］． Cell Mol Biol Lett，2010，15:424 －439．

3 Guo SZ，Wang NF，Zhou L，et al． Influence of granulocyte colony －stimulating factor on cardiac function in patients with acute myocardial infarction and leukopenia after revascularization ［J］． Chin Med J，2010，123:1827 －1832．

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5 Askari AT，Unzek S，Popovic ZB，et al． Effect of stromal－cell－derived factor1 on stem－cell homing and tissue regeneration in ischaemic cardiomyopathy ［J］． The Lancet，2003，362:697 －703．

6 Kocher AA，Schuster MD，Szabolcs MJ，et al． Neovascularization of ischemic myocardium by human bone－marrow－derived angioblasts prevents cardiomyocyte apoptosis，reduces remodeling and improves cardiac function ［J］． Nat Med，2001，7:430 －436．

7 Kazuki Y，Hiratsuka M，Takiguchi M，et al． Complete genetic correction of ips cells from Duchenne muscular dystrophy ［J］． Mol Ther，2010，18:386 －393．

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10 Li TS，Cheng K，Malliaras K，et al． Expansion of human cardiac stem cells in physiological oxygen improves cell production efficiency and potency for myocardial repair ［J］． Cardiovasc Res，2011，89:157 －165．

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14 Orlic D，Kajstura J，Chimenti S，et al． Bone marrow cells regenerate infracted myocardium ［J］． Nature，2001，410:701 －705．

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