白藜芦醇对胆固醇酯水解酶的调节作用

张凤香，贺成业, 关 宁，李晨光，罗俊生

辽宁医学院附属第一医院 心外科，辽宁锦州 121001

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)严重危害人类健康，引发心脑血管疾病，是一种常见和多发的疾病，其发病率和病死率均较高。因此，预防和控制AS疾病是亟待解决的问题。白藜芦醇(resveratrol)是一种非黄酮类多酚化合物，存在于葡萄科、百合科、豆科等多种植物中[1]。大量研究结果显示，白藜芦醇具有保护心血管、抗肿瘤、抗炎症和抗氧化等多方面作用；白藜芦醇经口服后能迅速被人体吸收、分布和代谢[2-3]。我们前期研究已初步探明白藜芦醇能通过增强胆固醇酯水解酶(carboxylic ester hydrolase，CEH)的表达抑制泡沫细胞形成，并且促进胆固醇外流。本研究是在此基础上用动物实验进一步验证白藜芦醇是否可通过影响CEH表达预防动脉粥样硬化形成。

材料和方法

1 实验动物及材料 ApoE-/-小鼠雄性40只，8周龄，购自北京维通利华有限公司(动物许可证编号SCXK京2006-0004)。饲养于符合二级动物饲养标准的辽宁医学院动物研究所。白藜芦醇购自Sigma公司；补体因子H(complement factor H，CFH)多克隆抗体、VCAM-1多克隆抗体、鼠抗β-actin一抗、二抗均购自美国Abcam公司；DAB显色试剂盒购自碧云天公司；CEH的基因序列由QIAGEN公司设计；CEH siRNA的序列：CEH siRNA正义链5'-UCAGGACUUGGCUGAACUUU-3'；反义链5'-AGA UAGCCAAGUCGGCGACA-3'。

2 分组 将动物模型分为四组，每组10只。白藜芦醇组：100 μg/kg小鼠腹腔注射，每周2次，高脂饮食，共10周。CEH siRNA组：100 μl/100 μl PBS腹腔注射，每周2次，高脂饮食，共10周。白藜芦醇+CEH siRNA组：依上述条件腹腔注射，每周2次，高脂饮食，共10周。对照组：不进行任何干预，高脂饮食10周。

3 血脂水平检测 血液从腹主动脉收集于肝素抗凝管，离心3 000 r/min，10 min。而后血浆在-80 ℃冰箱内保存。采用全自动生化分析仪及血生化测定试剂盒，检测总TC、TG、HDL-C含量和LDL-C含量，所有操作步骤按仪器说明书进行。单位以mmol/L表示。

4 病理观察 将4%多聚甲醛固定后的主动脉切成3~4 mm长度组织块，冰冻包埋。冰冻包埋：用OCT包埋组织，锡纸包裹，放-40 ℃冰箱中备用。将包埋的组织蜡块分别连续切片，切片厚5 μm，于60 ℃烤片机烤2 h，然后分别用于油红O染色、HE染色，光镜下观察各组主动脉内膜、中膜的病变，CMIA彩色病理图像分析系统计算其厚度。

5 qRT-PCR检测CFH及VCAM-1的表达 具体步骤参照反转录试剂盒说明书进行反转录反应。反应条件如下 ：95 ℃ 15 min ；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃2 min，共30个循环。取10 μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析。qRT-PCR法检测CFH的表达，上游引物为：5'-GCACTTGGATCCACCCAGAA-3'，下游引物为：5'-GAAGTTGTCAAAGATGGTGCCAG A-3'。VCAM-1的表达上游引物为：5'-CTGCTCAC CCAACATTTCGT-3'，下游引物为：5'-GTGGTTTGT CCAAACTCATCAA-3'。内参β-actin的上游引物为：5'-ACCCTGAAGTACCCCATCG-3'，下游引物为：5'-TAGCACAGCCTGGATAGCAA-3'。

6 Western blot检测CFH及VCAM-1的表达 用pH 7.4 含 50 mmol/L Tris-HCl、0.15 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、0.1% Triton X-100和0.1%十二烷基硫酸钠的蛋白裂解液提取胸主动脉的总蛋白，蛋白浓度参照BCA试剂盒测定。煮沸变性的蛋白以每孔40 μg的含量加样，经浓缩胶6%，分离胶10%的SDS-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离。通过电转仪将凝胶上的蛋白样品转至PVDF膜上，5%脱脂奶粉在37 ℃封闭2 h。分别与1∶300兔抗人CFH，1∶2 000鼠抗人VCAM-1抗体4 ℃孵育过夜。TBST洗膜3次，每次10 min。后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗鼠IgG(1∶500)羊抗兔IgG(1∶500)，4 ℃孵育2 h。洗膜3次，每次10 min。ECL发光试剂盒发光显影，凝胶成像。

7 统计学处理 所有数据均用SPSS13.0软件进行统计学分析，所得结果用-x±s表示，采用ANOVA分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 白藜芦醇与CEH对ApoE-/-小鼠血脂的影响白藜芦醇+CEH siRNA和白藜芦醇组TC和TG均略有降低，而HDL-C略有升高；CEH siRNA组TC和TG均略有升高，而HDL-C略有降低。但与对照组相比均无统计学差异；白藜芦醇组LDL-C与对照组相比下降(P＜0.05)，白藜芦醇组LDL-C与白藜芦醇+CEH siRNA组相比下降(P＜0.05)，而CEH siRNA组LDL-C与对照组相比升高(P＜0.05)说明白藜芦醇可能通过CEH影响LDL-C的形成，见表1。

表1 各组间血脂各项指标比较(mmol/L,

表1 各组间血脂各项指标比较(mmol/L,

aP＜0.05，与对照组比较；bP＜0.05，与白藜芦醇+CEH siRNA组比较

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2 主动脉内膜厚度比较 光镜下发现，对照组主动脉内膜明显增厚，斑块内可见大量泡沫细胞，斑块下中膜也呈不同程度破坏；白藜芦醇组主动脉内膜轻度增厚，斑块内仅见少量泡沫细胞，与空白对照组和白藜芦醇+CEH siRNA组相比明显减轻(P＜0.01)，与空白对照组和白藜芦醇+CEH siRNA组相比中膜增厚不明显(P＜0.01)；而CEH siRNA组内膜增厚，泡沫细胞与空白对照组相比明显增多(P＜0.01)，中膜增厚，与对照组相比无统计学意义。见表2。

表2 主动脉内膜、中膜厚度比较(μm,

表2 主动脉内膜、中膜厚度比较(μm,

aP＜0.01，与对照组比较；bP＜0.01，与白藜芦醇+CEH siRNA组比较

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3 白藜芦醇与CEH对VCAM-1表达的影响 qRTPCR和Western Blot检测发现:白藜芦醇组VCAM-1的表达和对照组比较降低；CEH siRNA组VCAM-1的表达与对照组比较增加。见图1。

4 白藜芦醇与CEH对CFH表达的影响 qRT-PCR和Western Blot检测发现；白藜芦醇组小鼠CFH的表达与对照组比较增强；CEH siRNA组小鼠CFH的表达与对照组比较降低。见图2。

讨 论

动脉粥样硬化是一种慢性炎症性血管疾病，严重威胁人类健康。近年来研究发现，CEH可以水解细胞内胆固醇酯(cholesteryl esters，CEs)使其成为游离胆固醇(free cholesterol，FC)，以促进胆固醇流出细胞，从而降低细胞中CEs的蓄积，保持细胞内脂质的稳定，抑制巨噬细胞向泡沫细胞转化[4]。有研究报道，CEH的表达水平与动脉粥样硬化的易感性密切相关，两者之间呈负相关[5]。

白藜芦醇及其衍生物近年来受到广泛重视，其抗动脉粥样硬化作用也逐渐成为研究热点，本实验是在前期研究的基础上进一步研究白藜芦醇与CEH之间的关系。本研究采用ApoE-/-小鼠构建动物模型，我们对ApoE-/-小鼠予以高脂饲料喂养同时加白藜芦醇和(或)CEH siRNA干预10周后，检测各组小鼠的各项血脂指标，本研究结果显示，与对照组相比，白藜芦醇组LDL-C明显下降，主动脉内膜轻度增厚，斑块内仅见少量泡沫细胞，中膜增厚不明显；CEH siRNA组LDL-C明显升高，内膜增厚，泡沫细胞明显增多，中膜增厚明显；TC、TG、HDL-C水平与对照组比差异无统计学意义。该结果说明白藜芦醇可以通过CEH影响机体内血脂水平，从而影响动脉粥样斑块的形成。

补体在AS形成过程中起着非常重要的作用。CFH是旁路途径的抑制因子，它可与B因子竞争性结合C3，减少C3转化酶的形成，使分解产物减少，从而达到降低动脉粥样硬化斑块形成的目的。细胞黏附是始动及加速AS发生、发展的分子基础，其中血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1)在介导单核细胞向内皮黏附、迁移过程中起到极其重要的作用。当血管内皮受损时，机体高表达VCAM-1，促使单核细胞及T淋巴细胞与内皮细胞发生粘连，进而加速动脉粥样斑块的形成。本研究结果发现白藜芦醇组CFH的表达明显强于对照组，而VCAM-1的表达明显低于对照组；CEH siRNA组CFH的表达明显弱于对照组，但VCAM-1的表达却明显强于对照组。该研究结果的发现证明白藜芦醇可以通过CEH影响动脉粥样硬化相关因子的表达，进一步说明白藜芦醇与CEH在预防动脉粥样斑块形成过程中存在着某种联系。综上，该研究结果的发现可能为动脉粥样硬化斑块防治提供新的思路。

图1 A： Western Blot； B：qRT-PCR(aP＜0.05， 与对照组比较)

图2 A； Western Blot结果；B：qRT-PCR结果(aP＜0.05， 与对照组比较)

1 Pervaiz S. Resveratrol： from grapevines to mammalian biology［J］.FASEB J， 2003， 17（14）： 1975-1985.

2 Sadruddin S， Arora R. Resveratrol： biologic and therapeutic implications［J］. J Cardiometab Syndr， 2009， 4（2）： 102-106.

3 Bishayee A. Cancer prevention and treatment with resveratrol： from rodent studies to clinical trials［J］. Cancer Prev Res （Phila），2009， 2（5）： 409-418.

4 Zhao B， Fisher BJ， St Clair RW， et al. Redistribution of macrophage cholesteryl ester hydrolase from cytoplasm to lipid droplets upon lipid loading［J］. J Lipid Res， 2005， 46（10）：2114-2121.

5 Rothblat GH， de la Llera-Moya M， Favari E， et al. Cellular cholesterol flux studies： methodological considerations［J］.Atherosclerosis， 2002， 163（1）：1-8.