蜂胶黄酮对环磷酰胺诱导HL7702细胞损伤的保护作用

张 良

蜂胶是经验丰富的工蜂采集生命力极强的白杨、白桦、榕树等嫩芽和花蕾及树脂类物质，归巢后几番吐哺，与其舌腺分泌物混合而制成的胶粘物质。蜂胶乙醇提取物(EPF)中含有丰富的黄酮类化合物、脂肪酸及酯类、氨基酸、维生素和多种活性酶类。研究发现，蜂胶黄酮(EPF)对环磷酰胺(CTX)致肝正常细胞HL-7702损伤具有保护作用，为证实此观点，笔者进行了动物实验，旨在进一步研究并证实EPF对化疗药物损伤的保护作用，为进一步将其开发为新型高效的天然抗肿瘤药物和细胞保护剂奠定基础。

1 材料和方法

1.1 材料 EPF:由日本医科大学生命科学中心采用乙醇提取，紫外光谱鉴定并定量检测。人正常肝细胞(HL-7702)由日本医科大学生命科学研究中心提供。WST-1凋亡检测试剂盒、Annexin VFITC/PI凋亡检测试剂盒购自Qiagen公司;氧化氢酶(CAT)、乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶(CK)、谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)等活性及尿素氮(BUN)试剂盒、EB/溴化乙锭、吖啶橙购自罗氏公司。BALB/C野生型小鼠，6周龄(购自日本琦玉县KUREA株式会社)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 在含10%灭活新生牛血清的RPMI1640完全培养液中，置37℃、5%CO2培养箱中培养，2～3 d传代一次。细胞生长曲线实验:将对数生长期的HL7702细胞用0.25%胰酶消化，含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液吹打成单细胞悬液，调整细胞密度为1×104/mL，每孔100 μL，分别加入到4块96孔培养板中，置于37℃、5%CO2的培养箱中继续培养。24 h细胞贴壁后，向各孔中分别加入 CTX 4 ng/L、EPF(20、30、40 ng/L，每个浓度设5个复孔)。分别培养24 h，PBS冲洗3次后，各孔加入100 μL无血清培养基和10 μL WST-1，继续在37℃、5%CO2饱和湿度培养箱培养1 h。酶标仪测定各孔OD值(光密度)，空白孔调零，选择450 nm为测定波长、630 nm为参考波长，以药物浓度为横坐标、OD为纵坐标绘制细胞生长曲线。实验重复3次，确定结果稳定性。

1.2.2 蜂胶黄酮提取 称取蜂胶1.0 g，乙醇加至100 mL，漩涡混合，超声波发射器超声20 min，500 r/min离心2 min，重复超声处理20 min，反复上述步骤2次，70%乙醇溶解并紫外光谱分析仪鉴定，阳性对照为芦丁。

1.2.3 吖啶橙/溴化乙锭(AO/EB)双染色实验24孔板按5×104个细胞/孔密度接种细胞悬液，培养24 h后向各孔中分别加CTX(4 ng/L)、EPF(20、40、60 ng/L)，继续培养 24 h，弃去培养基，PBS清洗2遍，每孔分别加200 μL AO染液(100 mg/L)及 200 μL EB 染液(100 mg/L)，室温放置5 min，在荧光显微镜下观察。

1.2.4 Annexin-V-FITC/PI流式细胞仪检测细胞凋亡 细胞处理方法同上，PBS清洗细胞2次，0.25%胰酶消化细胞，500 r/min离心5 min收集细胞。收集1×106单细胞悬液，加入Binding buffer 100 μL和 Annexin-V-FITC(20 μg/mL)10 μL，室温避光30 min。加入 PI(50 μg/mL)5 μL，用 Binding buffer加至400 μL，用FACS进行流式细胞术定量检测。

1.2.5 动物模型 健康鼠随机均分为5组，雌雄各半。对照组灌胃生理盐水;模型组单独给予CTX;3个剂量试验组每天分别灌服样品100、200、400 mg/mL，0.5 mL/只，连续给药 10 d，同时注射CTX 0.15 g/kg，共3 d。小鼠眼眶取血检测外周血象，肝素抗凝，根据试剂盒操作过程分析检测血清检测中各项酶的指标。

1.2.6 统计分析 应用SPSS 13.0统计软件。计量数据以x¯±s表示，两组均数间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 EPF对CTX诱导的HL7702生长抑制影响对人肝细胞系HL7702生长增殖的影响，如图1所示，在单独存在CTX(4 ng/L)时，HL-7702均处于生长抑制状态;加入EPF时，实验组细胞生长抑制明显改善，并随着EPF多肽浓度的增加，当EPF浓度达到40 ng/L时，促进生长作用显著增加，各组与阴性对照组比较差异有统计学意义。结果显示，EPF对CTX诱导的HL7702生长抑制具有拮抗作用。

图1 EPF对CTX处理HL-7702的保护作用

2.2 EPF对CTX诱导的HL7702细胞凋亡形态影响 见图2。结果显示，单独应用CTX(4 ng/L)组，绝大部分细胞核被染成橙红色，核皱缩或碎裂，为晚期凋亡或死亡细胞。EPF与CTX联合应用，EPF肽强烈抑制CTX对HL7702的损伤作用。凋亡细胞明显减少，绝大多数细胞形态饱满，几乎没有死亡细胞。AO/EB染色实验结果表明，从形态角度观察，EPF对CTX诱导的HL7702细胞凋亡形态影响具有抑制作用。

图2 EPF对CTX处理的HL7702AO/EB双染结果

2.3 EPF对CTX诱导的HL7702细胞凋亡影响Annexin-V-FITC/PI染色，流式细胞术分析细胞凋亡实验结果见图3。CTX单独处理的HL7702细胞组24 h晚期凋亡细胞占30.2%，CTX与EPF共处理细胞组凋亡细胞分别占19.2%、13.1%和7.1%，随着EPF浓度增加，凋亡细胞逐渐减少，活细胞和早期凋亡细胞明显增多。CTX单独处理的HL7702细胞组24 h早期凋亡细胞占57.2%，CTX与EPF共处理细胞组凋亡细胞分别占29.7%、17.1%和9.5%，随着EPF浓度增加，早期凋亡细胞逐渐减少，活细胞明显增多。

2.4 EPF对小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影响 如图4所示，模型组小鼠血清CAT、LDH、CK、GOT和GPT等酶活性以及血清BUN含量与对照组差异有统计学意义，然而此类CTX介导的毒性反应均在一定程度上被EPF缓解。

图3 EPF对CTX处理的HL7702细胞凋亡率影响

图4 EPF对小鼠血清酶活性和尿素氮含量的影响

3 讨论

恶性肿瘤的治疗手段有多种，化疗仍是目前极为重要的基本手段之一［1-2］，且存在靶向性差异。多数抗肿瘤药物均可在杀死肿瘤细胞的同时，无选择地破坏正常组织，造成广泛与严重的急/慢性蓄积毒性，导致化疗药物的剂量限制而引起治疗指数狭小的不良反应，限制了癌症治疗的最佳用药［3］。同时，化疗药物作用可引起机体衰弱、消化障碍、骨髓抑制等不良反应也是终止肿瘤治疗的主要原因，因此，在抗肿瘤治疗时，能最大程度地杀伤肿瘤细胞且对正常组织破坏最小已经成为化疗药物临床应用的目标。其相关研究也是当今抗肿瘤药物研究与开发领域的一大热点［4］。

蜂胶是蜜蜂从植物的幼芽和枝条上采集的树脂类物质，蜂胶提取物无明显肝肾功能损害。其在不同地区化学成分各异，生理活性亦不同。笔者采用乙醇纯化方法提取的蜂胶主要成分为黄酮类。黄酮化合物有抗菌、抑制肿瘤细胞生长、降压、预防紫外线损伤等作用。笔者前期研究发现EPF具有较好的化疗保护功能，并通过细胞实验和动物实验结果证实。为探求EPF对于CTX损伤HL7702细胞的保护作用，本研究采用WST-1细胞增殖试验。WST-1是一种类似于MTT的化合物，是MTT的升级替代产品，WST-1和MTT、XTT等相比，线性范围更宽，灵敏度更高。故实验结果更加精确可信。

在本研究中，在HL7702细胞培养液中分别加入CTX和不同浓度的EPF(20～40 ng/L)，培养24 h，细胞的增殖抑制在EPF浓度达到20 ng/L后得到改善，EPF浓度到40 ng/L后具有明显的保护作用，同样 AO/EB双染实验和 Annexin-V-FITC/PI流式细胞实验也支持这一实验结果。

动物实验结果进一步确定EPF对CTX化疗损伤的保护作用，这可能与EPF具有抗氧作用有关。EPF可以清除体内过多的自由基，减少自由基对机体正常细胞的损伤，维持体内抗氧化系统的平衡，有效抑制CTX造成的机体自由基损伤［5-6］，表现为血清CAT下降，同时对CTX导致的肝损伤具有明显的保护作用，表现为GOT与GPT下降。本研究显示，CPF具有对CTX引起的化疗损伤较明显的保护作用，为进一步研究和应用提供理论依据。

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［1］Carini F，Saggese V，Porcaro G，et al.Surgical protocol in patients at risk for bisphosphonate osteonecrosis of the jaws:clinical use of serum telopetide CTX in preventive monitoring of surgical risk［J］.Ann Stomatol(Roma)，2012，3(1):31-36.

［2］Min Wu，Mark R，Kelley W，et al.Reduction of BCNU toxicity to lung cells by high-level expression of O6-methylguanine-DNA methyltransferase［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2001，280(4):755-761.

［3］Ragg S，Xu-Welliver M，Bailey J，et al.Direct reversal of DNA damage by mutant methyltransferase protein protects mice against dose-intensified chemotherapy and leads to in vivo selection of hematopoietic stem cells［J］.Cancer Res，2000，60(18):5187-5195.

［4］马培奇.细胞保护剂氨磷汀及其临床应用及展望［J］.中国肿瘤，2001，10(8):471.

［5］Arap W，Pasqulini R，Ruoslahti E.Cancer treatment by targeted drug delivery to tumor vasculature in a mouse model［J］.Science，1998，279(5349):377-380.

［6］Stollman TH，Ruers TJ，Oyen WJ，et al.New targeted probes for radioimaging of angiogenesis［J］.Methods，2009，48(2):188-192.