经手术切除甲状腺和嗅球的大鼠有可能成为一种难治性抑郁症的实验动物模型

（广西医科大学人体解剖学教研室，广西 南宁 530021）

由于难治性抑郁症（treatment-resistant depression,TRD）的病因复杂，发生机制仍未完全清楚，并对抗抑郁药物等治疗措施表现出不敏感甚至发生抵抗[1,2]，这不仅对患者产生消极影响，而且给其家庭带来沉重负担，故揭示此病的原因与发病机制并制定出良好的综合治疗方案显得尤为重要。经过长期不懈的探索，目前发现部分 TRD患者伴有亚临床或隐性甲状腺功能低下的现象[3,4]，而且联合应用抗抑郁药物与甲状腺素治疗这类患者竟然可以纠正相关症状[5,6]，提示甲状腺功能低下可能是促进原发性抑郁症转变成为 TRD的一个诱因。为阐明伴有甲状腺功能障碍 TRD的病理变化缘由及其外在表现过程，有必要通过建立动物模型来加以钻研[7]。然而，在这方面迄今仍未见有完全应用外科手术方式制作动物模型的有关报道。鉴于存在这种不足之处，本研究通过外科手术切除大鼠甲状腺和嗅球建立相应的 TRD模型；测试由此大鼠模型所诱发的行为变化的模式与程度，进而分析这个模型的可行性，为今后从事药物筛选及用药物干预提供基础性资料。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）实验动物

清洁级健康雄性 Sprague-Dawley 大鼠 30只，体重为150～200g，由广西医科大学实验动物中心提供，合格证号为SCXK桂 2009-0002。在领取到大鼠后，将大鼠置于本教研室的实验动物室内，用大小鼠维持饲料[北京科澳协力饲料有限公司生产，饲料生产企业审查合格证号：京饲审（2009）06166，执行标准：GB14924.3－2010]饲养 1周，在自然光照条件下让大鼠自由饮水与摄食，以适应于新环境，随后手术建立动物模型。

（2）试剂与仪器

吸收性明胶海绵由南昌市祥恩堂医疗器械有限公司生产。阿莫西林胶囊由哈药集团三精明水药业有限公司生产。葡萄糖酸钙片为山西振东泰盛制药有限公司的产品（规格：0.5g/片，产品批号：20130203）。4号不锈钢牙科磨钻为日本MANI INC公司研制。Morris水迷宫测试系统由中国医学科学院药物研究所研制。江湾I型C大鼠脑立体定位仪由上海花木农机厂研制。旷场试验（open field test）的立体敞箱、强迫游泳试验（forced swimming test）的圆柱体容器为本科室分别根据其他学者的报道[8,9]自行制作。

1.2 方法

（1）动物分组

采用随机数字表法，将30只大鼠随机分成3组，每组10只：模型组、假手术组、正常对照组。

（2）动物模型的建立

按照其他学者已报道的方法[10]，对模型组大鼠进行甲状腺切除术，主要步骤如下：3.5%水合氯醛（350mg/kg体重）腹腔注射麻醉，将大鼠仰卧，常规消毒与备皮，沿颈部正中线切开皮肤，钝性分离皮下组织与肌肉，充分暴露甲状腺，将甲状腺的两侧叶及中间的峡部完全切除掉，止血并逐层缝合伤口。术后按常规用含有10%葡萄糖酸钙的自来水让模型组大鼠饮用直到本研究完全结束为止[11]，并让大鼠恢复 1周。继之再对模型组的大鼠行双侧嗅球切除术，按照其他学者已报道的方法[12]，将大鼠头部固定在大鼠脑立体定位仪上，暴露出颅骨，在距前囟前7～8mm处与颅骨顶部正中线两侧各旁开2mm的相交点处，用牙科磨钻将颅顶骨钻出两个直径约2mm的小孔，将微小探针伸入到小孔内，不断搅动将嗅球破坏成末糊状，再用橡皮吸引器将其轻柔地吸出到小孔以外，迅速将吸收性明胶海绵填充到小孔内止血，逐层缝合伤口。在依次完成以上两种手术后，均将阿莫西林粉末投入伤口内或伤口缝合处，防止感染。对于假手术组大鼠的两次手术，除了不切除甲状腺和双侧嗅球外，其余步骤均与上述手术的完全相同，对于正常对照组的大鼠则不进行任何处理，但对这两组的所有大鼠均用自来水供其饮用，而饲养料则与模型组大鼠的完全相同。在嗅球切除术后的第15天做行为测试。

（3）旷场试验[8]

此实验是在一个用金属板（厚度约0.2 cm）制成的立体形敞箱内进行的。此箱的长度和宽度均为80cm，高度为40cm，用黑色油漆涂于其内表面，在底部以边长为15cm的等长度，将其划分成为 25个正方形格子（15cm×15cm）。实验时将大鼠轻放入到底部的中央格子内，然后记录大鼠在3min内走动跨越过格子的总数（在本研究中，只有当大鼠的两前肢与一后肢同时进入格子内才被确定为越过一格，即水平活动得分，crossing score，单位：格）；同时记录大鼠两前肢完全离开地面的向上站立次数（即垂直活动得分，rearing score，单位：次）。此试验测定大鼠的活动程度与焦虑状态，实验在上午8∶00～11∶00时间段进行。

（4）强迫游泳试验

完全按照Porsalt等的设计[9]，用厚度为0.4cm透明无色的有机玻璃板做成内直径为18cm，高度为40cm的圆柱体容器。在预适应试验时，先将自来水倒入到该容器内，使水量达到18cm的高度（水温24～26OC），再将每只大鼠放入到该圆柱体容器内15min。大鼠首先有不断挣扎、奋力游泳或潜水等表现，但经过数分钟后大鼠知道是不可能逃出该容器的，于是变得活动次数越来越少，最终保持只有鼻孔露出水面的不动状态。通过上述预训练后，让大鼠休息24h，第二天将大鼠放入到盛有等体积水的圆柱体容器内，记录在 5min内的不动时间（immobility time，单位：秒）。在本研究中，大鼠在5min内必须是有明显的主动向周围游泳或向上窜爬或潜水等才被认定为游泳状态，而大鼠只有被动性的微小前肢活动，并以此来保持鼻孔露出在水平面上呼吸，则被认定为不游泳（不动）状态。此试验是测定抑郁症最严重症状之一绝望状态的有效方法，被测试大鼠的不动时间越长，表示其绝望程度越严重。实验在下午14∶30～17∶30时间段进行。

（5）水迷宫测试

先将各组大鼠放入到盛有自来水的圆形游泳池（直径156cm，用黑色油漆涂于其内表面，水温为24～26OC）内，让其自行游泳2min以适应于即将被测试的环境。在适应性训练后24h，即进行航行定位试验：每只大鼠分别被从游泳池的4个不同的固定位置，在保持大鼠的头面部朝向池壁的条件下轻放入水中，记录每次在2min内，每只大鼠自行找到并爬上所放置的平台（直径为10cm, 高度为28cm，使平台顶部低于水平面1cm）的实际时间，共计4次，即为逃避潜伏期（单位：秒）。每日在上午（8∶00～12∶00）与下午（14∶30～18∶30）两个时间段进行，共连续测试4天（8个时间段）。逃避潜伏期越长，表示空间学习能力越差。在试验的第 5天，将放置在游泳池内的平台取出，然后进行空间探索试验：将大鼠从游泳池的一个固定点轻放入水中（头面部朝向池壁），记录大鼠在2min内自行在原来放置平台象限内的实际游泳时间（在平台象限时间，单位：秒）。在平台象限游泳时间越长，表示空间记忆能力越强。

（6）固定与检查手术效果

在完成全部行为测试后，水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，开胸经左心室插管至升主动脉, 用4%多聚甲醛（0.1mol/L磷酸盐缓冲液配制，pH7.4）原位灌注固定大鼠。固定完毕首先打开颈部，查看甲状腺被切除的状况，继之打开大鼠颅盖骨暴露出整个脑，检查双侧嗅球被切除的程度。经过以上细致的复查证实，用于本研究的模型组大鼠的甲状腺均已被完全切除掉；并将切除双侧嗅球（包括副嗅球）均达到70%以上且同时不损伤两侧前脑的模型组大鼠用于本研究，对于达不到上述要求的大鼠则从实验中剔除，一律不将他们的数据用于本研究的统计分析。

（7）统计学方法

用SPSS13.0统计软件中的单因素方差分析对原始数据进行统计处理。经统计得出的所有计量数据用均数±标准差（±s）表示。对于方差齐的各组均数间的两两比较用最小显著性差异检验，对于方差不齐的各组均数间的两两比较则用Games-Howell检验。所有统计界限均以双侧α=0.05作为判断各组之间相互比较差异具有统计学意义的水准。

2 结果

2.1 一般变化

模型组大鼠在接受甲状腺切除术后的第2～3天，便可恢复自由饮水与摄食，从这时到术后第 7天为止，模型组大鼠在摄食、饮水、活动等方面与假手术组大鼠或正常对照大鼠的基本相似。然而，在模型组大鼠再次接受双侧嗅球切除术后的第 6～14天，大鼠在鼠笼中走动过多，易被激怒、主动攻击或撕咬同伴，双方发生猛烈争斗；在手术后的第20～28天，这些行为变化程度逐渐减缓，同时大鼠身体变小，生长缓慢，毛发失去光泽变得粗糙，体重明显下降（与正常对照组大鼠或假手术组大鼠相比较，差异有统计学意义,P＜0.01，见表2）。相比之下，假手术组或正常对照组大鼠则无上述行为变化，两组大鼠的体重也相互接近，差异无统计学意义（P＞0.05，见表2）。

2.2 旷场试验与强迫游泳试验结果

在旷场试验中，模型组大鼠行走跨过的水平格子数、垂直站立次数大约是正常对照组或假手术组大鼠的 2倍多，与后两组相比较的差异有统计学意义（P＜0.01），但正常对照组大鼠与假手术组大鼠的这两个指标之间的差异却无统计学意义（P＞0.05）。在强迫游泳试验中，模型组大鼠的不动时间也大约是正常对照组或假手术组大鼠的 2倍多，与后两组之间的差异也有统计学意义（P＜0.01），而正常对照组大鼠与假手术组大鼠之间的差异则无统计学意义（P＞0.05），详见表1。

表1 三组大鼠旷场试验与强迫游泳试验的结果比较（±s）

表1 三组大鼠旷场试验与强迫游泳试验的结果比较（±s）

注：与正常对照组或假手术组比较，米P＜0.01

组别 鼠数 水平格子数（格） 垂直站立数（次） 不动时间（秒）正常对照组 10 29.70±8.23 5.40±1.71 72.80±19.23假手术组 10 33.80±11.56 6.00±2.87 68.60±17.02模型组 10 94.20±19.26 米 13.80±3.61米 148.40±30.44米

2.3 水迷宫测试结果

模型组大鼠的逃避潜伏期[4天（8个时间段）测试得到的总体均数±标准差]大约是正常对照组或假手术组大鼠的2倍，与后两组之间的差异具有统计学意义（P＜0.01），但正常对照组大鼠与假手术组大鼠之间的差异却无统计学意义（P＞0.05）。相比之下，模型组大鼠在原平台象限实际游泳时间则分别比正常对照组、假手术组大鼠缩短了89.6%和84.1%，与后两组之间的差异也有统计学意义（P＜0.01），而正常对照组大鼠与假手术组大鼠之间的差异则无统计学意义（P＞0.05），详见表2。

表2 三组大鼠体重与水迷宫测试的指标变化（±s）

表2 三组大鼠体重与水迷宫测试的指标变化（±s）

注：与正常对照组或假手术组比较，米P＜0.01

组别 鼠数 体重（克） 逃避潜伏期（秒）在平台象限时间（秒）正常对照组 10 309.60±16.37 21.32±7.16 65.40±7.82假手术组 10 301.10±8.66 22.45±6.87 63.50±10.61模型组 10 243.70±19.74米48.16±17.36 米 34.50±10.20米

3 讨论

在机体的正常状态下，甲状腺合成与分泌甲状腺素（四碘甲腺原氨酸，T4；三碘甲腺原氨酸，T3）是受到其上级器官——下丘脑和垂体控制的，他们自上而下形成了下丘脑——垂体——甲状腺的神经内分泌轴，从正、反两个途径进行相互调节。一方面，下丘脑分泌促甲状腺素释放激素（TRH），促进垂体合成与分泌促甲状腺素（TSH），TSH则刺激甲状腺合成与分泌 T3和T4，后两者最终通过作用于靶细胞内的受体，产生相应的生物学效应。另一方面，垂体或甲状腺所分泌的相应产物，根据体内与体外的变化，又可反过来对上一级器官的内分泌活动施加负反馈影响，使这三个器官的活动彼此协调，进而确保此轴在总体功能上处于相对的平衡状态，以便更有效地针对机体内外的刺激做出适宜应答[13]。

但在临床上可观察到，一些伴有甲状腺功能障碍 TRD患者血清的抗甲状腺抗体(抗甲状腺球蛋白抗体、抗甲状腺微粒体抗体、抗甲状腺过氧化物酶抗体)滴度升高、T3与T4水平下降以及TSH水平升高等生物化学指标的异常变化[2～4]，由此可以推测，患者体内的免疫系统产生了针对甲状腺的自身抗体，专门瞄准甲状腺而发动攻击，使甲状腺受到损伤，导致其合成分泌T3与T4的量减少，并对TSH的刺激呈现出反应迟钝；在这种状态下，TRH不得不再次催促垂体进一步分泌TSH来迫使已受损的甲状腺増加内分泌活动，导致 TSH异常升高。即便已有以上生物化学指标异常，这类患者此时依然不出现甲状腺功能低下的明显临床症状，而是处于缺乏相应症状的亚临床或隐性甲状腺功能低下的异常状态[1,3]。然而，甲状腺本身的这些病变及其隐性功能低下却很有可能加剧了患者原有抑郁症的病理生理的连锁反应，使抑郁症的核心临床症状，如心境低落、兴趣减退、绝望及伴有焦虑、学习记忆障碍等变得更具有迁延性和抵抗性，造成单独用抗抑郁药物或甲状腺素治疗无法消除这些症状，必须同时联合应用这两种药物治疗才能控制的严重后果[5,6]。由此可见，甲状腺功能低下与抑郁症共存、相互影响，可促进抑郁症朝向纵深方向发展，最终演变成为对药物治疗不起反应的TRD，故甲状腺功能低下与抑郁症可能是引发这类TRD的两个源头性因素。

基于以上临床资料与推测，我们以甲状腺功能低下与抑郁症作为建立动物模型的两个基本前提，针对性地切除同一只大鼠的甲状腺及其双侧嗅球，然后追踪观察并测试在手术后所诱发的行为变化，相关结果显示：模型组大鼠表现出生长缓慢、 易激怒、焦虑样行为、绝望状态及空间学习与记忆能力明显下降等，这些变化不仅与正常对照组或假手术组大鼠相比较差异有统计学意义（P＜0.01），还与其他学者在切除甲状腺或切除嗅球实验中所观察到的基本一致[14,15]，提示本研究的大鼠模型出现了伴有甲状腺功能低下的激越性抑郁样行为。

既往研究表明，单纯性甲状腺切除术是模仿甲状腺功能低下的一种常用术式[10]，通过切除甲状腺，消除甲状腺源性T3和 T4的来源，使模型动物出现生长发育停滞、抑郁样行为及学习记忆障碍等变化[15]。此外，其脑内的结构与神经递质（5-羟色胺、去甲肾上腺素等）也受到负性影响[1,7]。而单纯性嗅球切除术则是一种建立抑郁症模型的术式，在切除嗅球后，脑内可出现由此所触发的次生性结构损害与神经递质变化（杏仁核-海马-皮质环路、中缝核、蓝斑以及5-羟色胺、去甲肾上腺素等均遭受波及）[16～18]，模型动物表现出激越、抑郁样行为、学习记忆障碍等[12,14]。从上述可见，通过分别应用这两种手术建立的相应动物模型均有各自独特的原因、病理变化与行为表现，使得它们成为经得起考验的公认动物模型[15,17]。本研究在此基础上，先后将这两种手术有机结合起来，制成了对应的大鼠模型，不仅其原因与手术方式明确；而且在长生发育方面，含有甲状腺功能低下的外显成份，如生长缓慢及停滞、体重明显下降；但易激怒、主动攻击、撕咬、过度活动等却是嗅球切除的外显成分；而绝望状态和空间学习记忆障碍则很可能是通过甲状腺切除与嗅球切除两者共同施加影响而产生的最后表现。从本研究的模型可看出其行为变化的多样性，也提示在这些行为外观变化的背后或许潜藏着复杂的抑郁症病理变化，并可能具有持续的顽固性，导致单一用药治疗失败。若以上述作为背景并与伴有甲状腺功能低下 TRD的临床特征相比较即可见，本研究的大鼠模型在原因和行为变化方面与该 TRD的相应指标较为类似，因此其可能是模仿伴有甲状腺功能低下难治性抑郁症激越亚型的一种实验动物模型。此外，本研究所建立的大鼠模型出现异常行为的时间也较长（4～5周），这为长期联合应用药物治疗及观察疗效提供了时间保障。

总之，通过综合与伴有甲状腺功能低下 TRD相互比较与分析的结果可初歩认为，本研究建立的大鼠模型既有理论基础，又在病因与行为变化上与该病的有关临床特征较为相似，故由本研究所建立的大鼠模型可能具有潜质成为模拟伴有甲状腺功能低下 TRD亚型的一种动物模型；加上该模型出现异常行为的持续时间较长，也适合用于今后进行长期药物干预并揭示相关药理学机制的研究，如此也可通过后续工作来再次印证该模型的重复性、可靠性与实用性，使得本模型变得更为成熟。

[1]张延霞,张桂青.难治性抑郁症的发病机制研究现状[J].现代生物医学进展,2011,111(6):1194-1196.

[2]李艾莎.难治性抑郁症与非难治性抑郁症患者甲状腺素水平的比较[J].中国健康心理学杂志,2011,18(8):919-920.

[3]袁浩龙.难治性抑郁症及其生化改变[J].国外医学精神病学分册,1992,19(1):16-20.

[4]Kupka RW, Nolen WA, Post RM, et al. High rate of autoimmune thyroiditis in bipolar disorder: lack of association with lithium exposure[J].Biol Psychiatry,2002,51(4):305-311.

[5]朱毅平,金学敏.艾司西酞普兰联合左甲状腺素钠治疗抑郁症并发亚临床甲状腺功能减退 33例[J].医药导报,2010,29(9):1154-1156.

[6]Eitan RE, Landshut G, Lifschytz T, et al. The thyroid hormone,triiodothyronine, enhances fluoxetine-induced neurogenesis in rats:possible role in antidepressant-augmenting properties[J].Int J Neuropsycopharmacol, 2010, 13(5):553-561.

[7]Samuels BA, Leonardo ED, Gadient R, et al. Modeling treatment-resistant depression[J].Neuropharmacology, 2011,61(3):408-413.

[8]董莉,归绥琪,孟炜,等.实验性更年期抑郁症动物模型的建立和评价[J].中国临床康复,2004,8(27):5871-5873.

[9]Porsalt RD, Pichom ML, Jalfre M. Depression: a new animal model sensitive to antidepressant treatment[J].Nature,1977,266(5004):730-732.

[10]廖虹,文建华.温方对亚临床甲状腺功能减退症大鼠模型甲状腺功能和血脂的影响[J].四川中医,2010,28(12):16- 17.

[11]Dipippo VA, Powers A. Tamoxifen and ICI 182,780 interactions with thyroid hormone in the ovariectomizedthyroidectomized rat[J]. J Pharmacol Exp Ther,1997,281(1):142-148.

[12]陈红霞,张黎明,薛瑞,等.大鼠嗅球切除抑郁症动物模型的改进与评价[J].中国药理学通报,2011, 27(3):436-439.

[13]杨钢.内分泌生理与病理生理学[M].天津:天津科学技术出版社,2000:219-225.

[14]Song C, Zhang XY, Manku M. Increased phospholipase A2 activity and inflammatory response but decreased nerve growth factor expression in the olfactory bulbectomized rat model of depression: effects of chronic ethyl-eico-sapentaenoate treatment[J].J Neurosci,2009,29(1):14-22.

[15]Pineda-Reynoso M, Cano-Europa E,Blas-Valdivia V, et al.Hypothyroidism during neonatal and perinatal period induced by thyroidectomy of the mother causes depressive-like behavior in prepubertal rats[J].Neuropsychiatr Treat, 2010, 6:137-143.

[16]van der Stelt HM, Breuer ME,Olivier B, et al. Permanent deficits in serotonergic functioning of olfactory bulbectomized rats: an in vivo microdialysis study[J].Biol Psychiatry,2005, 57(9):1061-1067.

[17]Kelly JP,Wrvnn AS,Leonard BE.The olfactory bulbectomized rat as a model of depression: an update[J].Pharmacol Ther,1997,74(3):299-316.

[18]Nesterova IV, Gurevich EV,Nesterov VI,et al. Bulbectomyinduced loss of raphe neurons is counteracted by antidepressant treatment[J].Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,1997, 21(1):127-140.