水牛乳抗氧化活性肽制备中蛋白酶的选择

文 / 李 玲 曾庆坤* 农皓如 唐 艳 林 波

（中国农业科学院广西水牛研究所）

活性肽具有蛋白质及氨基酸不可比拟的功能活性，较蛋白质抗原性低，不易出现过敏现象，耐酸、耐热、溶解性好，风味比游离氨基酸更易接受，且吸收机制优于蛋白质及游离氨基酸[1]。目前发达国家，尤其是欧美以及日本，乳源肽功能食品市场已经形成较大规模，乳源肽婴幼儿食品、乳源肽抗过敏食品、乳源肽功能饮料等产品受到消费者的青睐。本文通过对水牛乳活性肽制备过程中的蛋白酶进行筛选，为水牛乳蛋白酶解工艺的优化以及水牛乳活性肽的开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

水牛乳：采自广西水牛研究所种畜场；碱性蛋白酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、动物复合蛋白酶、植物复合蛋白酶：南宁庞博生物技术有限公司；Protamex蛋白酶：诺维信公司；DPPH：Sigma公司；其余试剂为分析纯。

乳成分分析仪：FOSS，丹麦；pH计：Orion Research，美国；HH-4数显恒温水浴锅：江苏省金坛市金南仪器制造有限公司；紫外分光光度计：Perkin Elmer，美国； Alpha 1-2 LD真空冷冻干燥机：Christ，德国。

1.2 方法

1.2.1 蛋白酶酶活力的测定

参照GB/T 23527—2009。

1.2.2 水解度的计算

采用pH-Stat[2]滴定法。根据多肽在不同的pH值的条件下解离状态不同：当pH值恒定时，酶解蛋白后形成的自由羧基、自由氨基或氨基酸残基数目不等；当碱性条件下水解时，释放的氨基酸使溶液pH值明显下降，用稀碱液将其滴定回起始pH值，可知蛋白质的肽键断裂情况，根据消耗碱的量计算水解度DH值。

水解度=（水解的肽键数/总肽键数）×100%

计算公式：

公式中：VNaOH：滴定消耗的碱体积（mL）；

NNaOH：滴定消耗的碱当量浓度（mol/L）；

Mp：参加蛋白水解的蛋白质总量（g）；

Htot：每克蛋白质中肽键的克当量数（酪蛋白为8.2 mmol/g）；

α：α-氨基酸的平均解离度。

α的计算公式为：α=10pH-pK/（1+10pH-pK，pK=7.8+2 400×（298-T）/298T，T=273.15+t，t为反应环境的温度（℃），pH为反应起始pH值。

1.2.3 DPPH清除率的计算

参考Saiga A[3，4]等人的方法，配置0.1 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液，测定加样方法见表1。充分震荡混匀后，室温下反应30 min，在517 nm下测定吸光度值。清除率的计算公式如下：

1.2.4 酶解工艺

水牛乳→乳脂分离机脱脂乳（乳脂含量<0.5%水牛乳质量）→HCl调pH值至4.6→沉淀酪蛋白→过滤，弃滤液→酪蛋白加少量蒸馏水清洗多次至上清液无色→用0.05 mol/L的NaOH溶液在一定温度下溶解酪蛋白→完全溶解后→加蒸馏水调至实验所需酪蛋白底物浓度，并调pH值至酶解所需条件→取水牛乳酪蛋白溶液→加适量酶→在一定条件下进行酶解→反应中持续滴加0.5 mol/L的NaOH溶液维持反应体系pH值，并记录水解液所需碱液体积，计算水解度→水解完成后沸水中5 min使酶失活→快速冷却至室温→调节溶液pH值至4.6，4 200 r/min离心，去除未被水解的酪蛋白→取上清液，调节pH值至6.8，冷冻干燥→得到多肽。

表1 DPPH自由基清除率测定加样方法

1.2.5 各蛋白酶的最适反应条件

根据酶生产厂家提供的酶的最适反应pH值、时间以及温度条件，测定酶解底物的水解度及DPPH自由基清除率，选择最优的蛋白酶。各酶的水解条件如表2所示。

1.2.6 数据分析

数据均测定3 次，取平均值。

2 结果分析

2.1 蛋白酶的选择

图1 水解度的测定结果

不同蛋白酶对同一种蛋白质底物作用的酶切位点不一致，蛋白质水解物中多肽的分子链长度、结构、含量、组成、活性不同[5]。在制备抗氧化肽中常用的蛋白酶中选择木瓜蛋白酶、碱性蛋白酶、中性蛋白酶、动物复合蛋白酶、植物复合蛋白酶、Protamex蛋白酶作为实验用酶。由于各酶种类、来源差别很大，蛋白酶的活力在运输、保存过程中会发生变化，因此必须按照国际单位重新测定蛋白酶的活力，以规范酶活力单位。各种蛋白酶活力的测定结果如表3所示。根据酶活力来确定各种蛋白酶的加入量。

2.2 不同蛋白酶酶解过程中水解度的测定

不同蛋白酶对水牛乳蛋白的水解度如图1所示。在0～1 h，随着酶解时间的增加，各种酶酶解酪蛋白的水解度急剧增大；1 h后，随着水解的进行，由于可作用底物减少、肽键切割位点减少、蛋白酶部分失活以及产物积累对酶的竞争性抑制，水解度增加变缓。同等条件下达到稳定水解度时，各种酶的水解度大小为：碱性蛋白酶＞动物复合蛋白酶＞中性蛋白酶＞诺维信Protamex蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞植物复合蛋白酶。

表2 6 种酶的酶解条件

2.3 不同蛋白酶酶解物DPPH清除率的测定

对不同蛋白酶的酶解产物进行DPPH清除率测定，结果如图2所示：浓度为30 mg/mL的各酶解产物DPPH清除率大小为：碱性蛋白酶＞植物复合蛋白酶＞木瓜蛋白酶＞中性蛋白酶＞诺维信Protamex蛋白酶＞动物复合蛋白酶。

碱性蛋白酶对水牛乳蛋白的水解能力以及酶解物DPPH自由基清除能力最强，分别为24.30%以及66.63%。且碱性蛋白酶价格低廉，性价比高，最终选择碱性蛋白酶作为水牛乳的酶解蛋白酶。

表3 蛋白酶活力的测定结果

图2 酶解物DPPH自由基清除率

3 结论

以水牛乳为原料，采用木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、碱性蛋白酶、动物复合蛋白酶、诺维信复合蛋白酶、植物复合蛋白酶对水牛乳蛋白进行酶解实验，其中，采用碱性蛋白酶酶解水牛乳蛋白其水解度及酶解底物的DPPH自由基清除率最高，分别达到24.30%以及66.63%，最终选择碱性蛋白酶为水牛乳蛋白的水解蛋白酶。

[1]邹远东.蛋白质的酶法降解揭开了生命科学新的一页.当代经济，2005（4）：40-41.

[2]Mirquez M C，Ferundez V.pH-stat method to evaluate the heat inactivation of subtilis inhibitor in legumes.Chem Biochem Eng Q，2002，16（1）：31-35.

[3]Ting Sun，Chi T H.Antioxidant activities of buckwheat extracts.Food Chemistry，2005（90）：743-749.

[4]Saiga A，Tanabe S，Nishimura T.Antioxidant activity of peptides obtained from porcine myofibrillar proteins by protease treatment.Journal of Agricultural and Food Chemistr，2003（51）：3661-3667.

[5]王璋.食品酶学.北京：中国轻工业出版社，1994.