复制因子C亚基3基因突变对拟南芥开花和种子发育的影响

刘 颖 ，崔 看，陈良城，陈 锦，成 平 ，匡逢春 ，赵一夫 ，夏石头

（1.湖南农业大学生物科学技术学院，湖南省植物激素与生长发育重点实验室，湖南 长沙410128；2.湖南省农业信息与工程研究所，湖南 长沙 410125）

RFC（replication factor C，复制因子 C）是一种首先从人类Hela细胞提取物中纯化、由5个亚基组成的复合物，是猿病毒40（SV40）DNA体外复制的必需因子。人类复制因子C（human replication factor C，hRFC）也被称为激活子1，在ATP存在的条件下将分生细胞核抗原（proliferating-cell nuclear antigen,PCNA） 和 DNA 多聚酶 δ（polδ） 或 ε（polε）装配到附有引物的模板上，并在人类单链DNA结合蛋白（hSSB）存在条件下促使DNA链有效延伸。RFC的5个亚基，1个大亚基（RFC140/RFC1）和 4个小亚基（RFC37/RFC2，RFC36/RFC3，RFC40/RFC4和RFC38/RFC5），在所有真核生物中普遍存在[1-2]。

目前，已有研究表明RFC复合物与DNA复制、修复和细胞周期检验点控制有关[3-5]，但RFC复合物各亚基的具体功能仍不清楚，在植物中尤其如此。夏石头教授课题组在用EMS诱变筛选更多抗生物和非生物胁迫的突变体过程中，证实了突变体rfc3-1是一个由碱基G变为A的点突变体[6-7]，该点突变导致了植株早花、果荚生长和种子发育的缺陷，这表明AtRFC3在拟南芥花器官发育中起着重要作用。以拟南芥突变体rfc3-1为材料，对其花器官和种子发育进行了研究，以期揭示AtRFC3在拟南芥花器官和配子发育过程中的重要作用。

1 材料与方法

1.1 材料

供试材料为拟南芥哥伦比亚（Col）生态型和拟南芥rfc3-1突变体。

1.2 方法

1.2.1 RFC3基因突变对植物生长和表型的影响按照夏石头等[8]的方法，将rfc3-1突变体和野生型种子消毒、春化后播种在灭菌过的培养土上。待种子发芽，幼苗生长3 d后揭开培养盘盖，约10 d后将幼苗移栽到新培养土中，然后在16 h光照（23℃）/8 h黑暗（21℃）培养室条件下继续培养10周。在此过程中仔细观察植物的生长和表型。

1.2.2 RFC3基因突变对花和种荚的影响 植株开花后，至少取rfc3-1突变体和野生型植株各30朵花进行拍照，并测量花瓣的长度、宽度和花瓣的面积。待种子成熟后，分别采集rfc3-1突变体和野生型的种荚并计量种荚长度、种子数量和每个种荚中败育种子数。以上试验至少重复3次。

1.2.3 互补植株花器官性状检测 前期研究通过电击穿孔法将阳性克隆转入农杆菌GV3101菌株中，然后用花器官浸渍法[9]将其转化到rfc3-1纯合子植株中，通过Basta抗生素筛选得到遗传互补转化子植株。用于遗传互补植株检测的配对引物设计如 下 ：5’TTGACGCCATATGCGTTGAC3’ 和 5’TATGGTCCTCCCGGTACTCG 3’用于野生型基因RFC3序列的检测；5’TTGACGCCATATGCGTTG AC 3’和 5’TATGGTCCTCCCGGTACTCA 3’用于突变基因rfc3-1序列的检测。将验证后遗传互补植株和野生型植株播种到营养土上，开花后观测遗传互补植株的花器官发育表型。

2 结果与分析

2.1 RFC3基因突变对拟南芥植株生长及开花时间的影响

在相同生长条件下，rfc3-1突变纯合子植株移植21 d后开始开花，但野生型植株开花时间比突变体植株延迟1周。试验统计数据结果显示，rfc3-1突变纯合子植株开花时有8～9片真叶，并且大多数突变体植株开始长第9片真叶。但野生型植株此时只有6～7片真叶，并且大多数野生型植株才开始长第8片或者第9片真叶（图1）。这表明RFC3基因突变导致rfc3-1突变纯合子植株开花时间比野生型植株开花时间提早1周。

2.2 RFC3基因突变对拟南芥花型的影响

RFC3基因突变导致植株早花，且rfc3-1突变纯合子植株的花明显比野生型植株的小。对rfc3-1突变纯合子植株和野生型植株花瓣的长度、宽度和花瓣面积进行观测，结果如表1所示，rfc3-1突变体植株花瓣的长度比野生型植株减少15.72%，差异达到显著水平；rfc3-1突变体植株花瓣的宽度比野生型植株减少44.35%，差异达到显著水平；rfc3-1突变体植株的花瓣面积仅为野生型植株花瓣面积的53.67%，显著小于野生型植株的花瓣面积。

表1 野生型植株和rfc3-1突变体纯合子植株的花瓣性状

2.3 RFC3基因突变对拟南芥种荚发育的影响

为观测突变对rfc3-1植株的种子繁殖的影响，进一步检测了rfc3-1植株种荚长度、单个种荚中种子数量和败育种子数量。试验结果显示，在相同生长条件下，rfc3-1突变体植株种荚长度只有8.55±0.17 mm，比野生型植株种荚长度12.18±0.15 mm短29.8%，两者的差异达到了显著水平；野生型植株平均每个种荚有48.08±0.91个种子，其中败育种子有0.07±0.03个，而rfc3-1突变体植株中，平均每个种荚只有21.62±1.01个种子，其中有败育种子3.30±0.25个，野生型表型种子有18.32±0.76个。突变体植株的种子败育率为15.26%，显著高于野生型植株种子败育率（0.14%）。这表明RFC3基因突变显著影响基因的功能，并且导致种子发育异常。图2中显示了rfc3-1种荚中典型败育的种子。

2.4 rfc3-1突变体遗传互补验证

为进一步证实突变体植株的花、种子和胚胎发育表型缺陷是由于RFC3基因的点突变引起的，克隆了RFC3基因组DNA全序列和启动子序列，并通过农杆菌介导的花器官浸渍法转化到rfc3-1突变体纯合子植株中。经过两轮的Basta抗生素筛选，获得了35株rfc3-1的T1植株。并发现其中5株幼苗是rfc3-1突变体纯合子植株的遗传互补植株（rfc3-1/rfc3-1::RFC3）。另外，遗传互补植株的后代T2植株也通过特异性引物PCR得到进一步验证。互补型植株的种荚和种子性状与野生型植株的没有显著差别，和野生型植株类似，遗传互补植株的种荚几乎没有败育的种子，并且遗传互补植株的花也与野生型植株的相似。综上所述，RFC3基因组DNA全序列的遗传转化能完全互补突变体植株的表型，证实了rfc3-1植株花器官发育的缺陷表型是由于RFC3蛋白质的功能部分缺失所引起的。图3显示的是经PCR验证的2个典型遗传互补植株。

3 讨论与结论

rfc3-1突变纯合子植株在相同的生长条件下，开花时间比野生型植株早约1个星期；其花瓣平均面积比野生型植株降低了44.35%；种子败育比达15.26%，显著高于野生型。这说明RFC3突变影响了该基因的功能并导致种子败育。这与AtRFC复合物的大亚基突变导致rfc3-1突变体种子败育的表型是一致的，rfc3-1种子的败育可能是由胚胎发育异常所导致的。

RFC3在花器官发育过程中起着重要作用，在顶芽生长、开花初期阶段，以及种子发育的整个阶段，花粉和胚胎发育进程中都有很高的表达量。通过电子荧光象形网站（http://bbc.botany.utoronto.ca/efp/cgi-bin/efpWeb.cgi）的电子荧光杂交，发现A－tRFC3在拟南芥花器官的每个部位都有表达，但在不同阶段和花器的不同部位的表达水平不同。RFC3在茎尖、心皮、花粉和胚胎中高量表达，其中茎尖中的表达水平是最高的。此外，在干种子和吸胀24 h的种子，以及种荚发育的所有阶段，RFC3都有表达。在雄雌配子发育阶段，RFC3在柱头和子房组织中表达量都很高，且在花粉和胚胎发育所有阶段持续高水平表达。通过把野生型RFC3基因组DNA连同启动子序列转化到rfc3-1纯合子中可使其恢复野生型表型，说明花器官发育的缺陷是由于RFC3蛋白部分功能缺失造成的。AtRFC3在拟南芥花器官和配子发育过程中起着重要作用，但有关AtRFC3更详细的生物学功能及其机制有待进一步的研究。

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