苏芳菊,张卫泽,马凌,王菲,赵小华,敖雪玲,刘燕
·基础研究·
缺氧诱导因子1α在异丙肾上腺素诱导的大鼠心房纤维化中的表达及意义
苏芳菊,张卫泽,马凌,王菲,赵小华,敖雪玲,刘燕
目的探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)在盐酸异丙肾上腺素(ISO)诱导的大鼠心房纤维化中的表达及其可能机制。方法健康雄性Wistar大鼠30只,随机均分为空白对照组、ISO组、ISO+西罗莫司(Rapa)干预组(Rapa组)。于实验15d时处死大鼠取心肌组织,放射免疫法检测血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的含量,HE和Masson染色法观察纤维化程度即胶原容积分数(CVF),免疫组织化学法、Western blotting检测HIF-1α、转化生长因子β1(TGF-β1)和基质金属蛋白酶9(MMP-9)在大鼠心房纤维化组织中的表达,并分析HIF-1α、TGF-β1、MMP-9蛋白表达量与心房纤维化指标CVF的相关性,以及HIF-1α、TGF-β1、MMP-9蛋白表达量之间的相关性。结果ISO组、Rapa组AngⅡ含量较空白对照组明显升高(P<0.01)。空白对照组CVF为15.482%±0.837%,无心房纤维化,而Rapa组、ISO组CVF分别为16.730%±1.052%、86.704%±1.928%,Rapa组较ISO组的心房纤维化程度明显减弱(P<0.01)。免疫组化及Western blotting检测显示,与空白对照组相比,ISO组HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表达量均明显增加(P<0.01),与ISO组比较,Rapa组中HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表达量明显降低(P<0.01)。HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表达量均与心房纤维化程度(以CVF为评价指标)呈正相关(r=0.987,r=0.988,r=0.917,P<0.01);HIF-1α与TGF-β1、MMP-9蛋白表达量呈正相关(r=0.976,r=0.901,P<0.01),MMP-9与TGF-β1蛋白表达量亦呈正相关(r=0.912,P<0.01)。结论在异丙肾上腺素诱导的大鼠心房纤维化过程中,AngⅡ、HIF-1α、TGF-β1、MMP-9发挥着重要作用。
缺氧诱导因子1,α亚基;心房;纤维化;转化生长因子β1;基质金属蛋白酶9
心房颤动(atrial fibrillation,AF)在临床上有较高的致残率和致死率[1],也是常见的心律失常之一。近年来血管紧张素Ⅱ(angiotensin Ⅱ,AngⅡ)与AF发生及维持的关系已备受关注。发生AF时AngⅡ含量增加并可最终诱导心房纤维化[2],而心房间质纤维化具有诱发和维持AF的双重作用[3]。研究指出,缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)1α的升高与AngⅡ有关[4],并参与肾纤维化[5],但其在心肌纤维化中的作用未见报道。本研究参照Zhang等[6]的方法,采用皮下大剂量注射盐酸异丙基肾上腺素(isoproterenol,Iso)致AngⅡ升高建立大鼠心房纤维化模型,同时给予HIF-1α抑制剂(雷帕霉素)[7]干预,对心肌组织中AngⅡ、HIF-1α、转化生长因子β1(transforming growth factor-beta 1,TGF-β1)、基质金属蛋白酶9(matrix metallopmteinases 9,MMP-9)蛋白表达水平以及心房纤维化程度进行检测并分析其相关性,以初步探讨HIF-1α在Iso诱发心房纤维化过程中的作用及其可能机制。
1.1动物分组及模型建立 健康雄性Wistar 大鼠30只,体重180±20g,购自兰州军区兰州总医院动物中心,随机分为空白对照组、Iso组、Iso+西罗莫司(sirolimus,又名雷帕霉素,rapamycin,Rapa)干预组(Rapa组),每组10只。Iso组、Rapa组均按5mg/ (kg·d),1次/d,连续7d腹部多点皮下注射Iso(上海和丰制药有限公司,批号080705),Rapa组于注射Iso的第2天同时按3ml/(kg·d)连续给予西罗莫司口服液(杭州中美华东制药有限公司,规格50ml/50mg,批号110901)灌胃14d。上述给药的同时,空白对照组、Iso组分别用与Rapa组等量的双蒸水进行灌胃。全组大鼠15d后行颈椎脱臼处死。
1.2方法
1.2.1标本采集及保存 大鼠处死后取心脏,沿心脏冠状面最大横径处切除部分心肌组织置于10%甲醛溶液中固定24h,石蜡包埋,连续切片5张,其中2张用于HE和Masson染色,剩余3张用免疫组化法分别检测HIF-1α、TGF-β1和MMP-9的表达。剩余心脏组织置冻存管于液氮中保存,取部分采用放射免疫法检测Ang Ⅱ含量,部分采用Western blotting检测HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白的表达。
1.2.2大鼠心肌组织中Ang Ⅱ含量测定 参考AngⅡ放射免疫试剂盒(北京北方生物技术研究所)说明书,采用放射免疫法测其浓度。
1.2.3心肌纤维化观察 行常规HE和Masson染色。心房纤维化指标胶原容积分数(collagen volume fraction,CVF)计算公式为:CVF=胶原面积/全视野面积×100%。每张Masson染色切片选取3个无血管视野(×400),采用Image-Pro Plus6.0图像扫描软件进行图像分析,计算心肌CVF。
1.2.4免疫组织化学法检测 取心肌组织石蜡切片,经脱蜡、抗原热修复、封闭液封闭、一抗孵育、二抗孵育、DAB显色、复染、透明、封固等步骤,以PBS代替一抗作为阴性对照,阳性结果以试剂公司提供的阳性片为依据。兔抗大鼠HIF-1α、MMP-9、TGF-β1多克隆抗体及鼠抗GAPDH单克隆抗体均购于美国Santa Cruz公司,一抗工作液浓度均为1:50,二抗山羊抗兔由Jackson公司提供,工作浓度为1:500。
1.2.5Western blotting检测 将心肌组织块置于液氮预冷的研钵中,根据样本量加入适当的蛋白提取裂解液,离心、吸取上清,分装一小份测定蛋白浓度,另取100μg蛋白加入5×蛋白电泳上样液混匀,沸水浴处理5min、离心,取上样,加蛋白Marker(Fermentas公司),电泳;电转至NC膜(Millipore公司),将膜取下,剪角后封闭,孵育一抗,HIF-1α、MMP-9、TGF-β1目的蛋白抗体均按1:300稀释,4℃过夜,鼠抗GAPDH单克隆抗体作为内参,照按1:10 000稀释后4℃过夜;孵育二抗(目的蛋白羊抗兔1:2000,内参羊抗鼠1:2000),室温1h;洗膜,压片,显影,检测特异性蛋白条带。凝胶成像系统拍照,分析条带的面积和灰度,蛋白区带用积分灰度值(D)表达。
1.3统计学处理 采用SPSS 17.0软件进行统计分析,数据结果均以x±s表示,组间比较采用单因素方差分析,两两比较采用LSD-t法,并采用Pearson积差进行相关性分析,P<0.05为差异有统计学意义。
2.1大鼠心肌组织中AngⅡ的含量 采用放射免疫法测定,结果发现Iso组及Rapa组心肌组织AngⅡ含量(139.402±4.431、132.712±5.316ng/L)均明显高于空白对照组(31.172±7.271ng/L),差异有统计学意义(P<0.01)。
2.2心房肌间质纤维化程度
2.2.1HE染色结果 空白对照组心肌细胞核间距、细胞核沿心肌束的走行以及心肌组织间质纤维排列规整,无纤维化表现(图1A);Iso组心肌组织间质成分增多,细胞核间距增宽,纤维化程度明显且心肌纤维走行紊乱(图1B);与Iso组比较,Rapa组细胞核走行、心肌组织间质纤维增多程度以及间质纤维排列不规则程度均呈一定程度减轻(图1C)。
2.2.2Masson染色结果及CVF比较 光镜下可见正常心肌组织间质胶原成分呈现绿色(用亮绿复染),胞核呈现蓝色,心肌纤维、胞质以及红细胞呈红色。将图片进行分析,按前述方法计算心房纤维化程度(以CVF为指标),各组取平均值作为测量值。空白对照组CVF为15.482%±0.837%,无心房纤维化,而Rapa组、Iso组CVF分别为16.730%±1.052%、86.704%±1.928%,Rapa组较Iso组的心房纤维化程度明显减弱(P<0.01),Rapa组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05,图1D-F)。
图1 各组心房肌间质纤维化表现(×400)Fig. 1 Manifestation of atrial myocardial interstitial fibrosis (×400)A,D. Control group; B,E. Iso group; C,F. Rapa group. A-C. HE staining; D-F. Masson staining. Green represents myocardial interstitial collagen component
2.3免疫组织化学检测结果 光镜下可见正常心肌细胞(对照组)中HIF-1α、TGF-β1和MMP-9均表达于胞质,阳性染色呈棕黄色(图2)。Iso组HIF-1α、TGF-β1和MMP-9表达较空白对照组明显增加,而Rapa组HIF-1α、TGF-β1和MMP-9表达较Iso组明显减少。
2.4Western blotting检测结果 Iso组大鼠心肌组织中HIF-1α蛋白表达水平(0.579±0.025)明显高于空白对照组(0.293±0.015)和Rapa组(0.281±0.023,P<0.01),Rapa组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Iso组大鼠心肌组织中TGF-β1蛋白表达水平(1.446±0.085)明显高于空白对照组(0.661±0.044)及Rapa组(0.678±0.031,P<0.01),Rapa组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05)。Iso组大鼠心肌组织中MMP-9蛋白表达水平(1.751±0.086)明显高于空白对照组(1.159±0.145)及Rapa组(1.152±0.162,P<0.01),Rapa组与空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05,图3)。
2.5HIF-1α、TGF-β1和MMP-9表达水平与肌纤维化程度的关系 心肌组织中HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白表达量均与心房纤维化程度(以CVF为评价指标)呈正相关关系(r值分别为0.987、0.988、0.917,P<0.01);HIF-1α与TGF-β1、MMP-9蛋白表达量亦呈正相关(r=0.976、0.901,P<0.01);MMP-9与TGF-β1蛋白表达量呈正相关(r=0.912,P<0.01)。
多数研究表明,在AF时肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotensin-aldosterone system,RAAS)被激活,此时作为循环和局部组织中RAAS的主要效应分子[8],Ang Ⅱ含量增加并可最终诱导产生心房纤维化[2]。本实验中大鼠皮下多点大剂量连续注射Iso 7d,结果显示Iso组及Rapa组心肌组织中AngⅡ的含量均明显高于空白对照组,说明给予Iso注射后,RAAS启动,心肌组织中Ang Ⅱ表达增加,同时组织形态学观察发现空白对照组无心房纤维化,而Iso组心肌间质出现明显纤维化,表明AngⅡ在心肌组织中的高表达参与了心房纤维化的形成,这一结果与我们之前的研究[9]一致。
图2 各组心肌细胞中HIF-1α、TGF-β1、MMP-9表达量的比较(免疫组化 ×400)Fig. 2 Comparison of expression of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 in myocardial cells (Immunohistochemisty ×400)
图3 各组心肌组织中 HIF-1α、TGF-β1和MMP-9蛋白的表达(Western blotting)Fig. 3 Protein expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 in myocardial cells (Western blotting)A. Control group; B. Iso group; C. Rapa group
HIF-1α作为组织缺氧的指标产物,在组织缺氧时表达增多[10]。已有研究表明,Ang Ⅱ可使HIF-1α的表达升高并参与肾纤维化过程[5]。HIF-1α蛋白的高表达还参与肝纤维化[11]、肺纤维化[12]、肾纤维化[13]过程。AF状态下,快速心室率导致心房组织缺氧,心肌中HIF-1α表达增加并可能参与心房纤维化等心肌组织结构改变[14]。本研究从病理学表现、蛋白水平等方面进行分析发现:Iso组中HIF-1α表达明显高于空白对照组,同时给予HIF-1α抑制剂雷帕霉素干预后,Rapa组中HIF-1α表达明显下降,且均与心肌纤维化程度(CVF)呈正相关,提示HIF-1α表达增加参与了Iso诱导的心房纤维化形成。已有研究证实,雷帕霉素可减缓肾脏纤维化进展[15],本研究亦发现雷帕霉素可抑制心房纤维化,其机制可能为:哺乳类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是一种重要的信号转导分子[16],在纤维化损伤中起重要作用[17],而雷帕霉素能强烈抑制mTOR蛋白酶的催化活性[18],使其下游底物的磷酸化减弱或消失,阻断多种因子信号的下传,同时HIF-1α也是mTOR的下游作用靶点[19],因此,雷帕霉素可能是通过抑制HIF-1α的表达而减轻心房纤维化。
TGF-β1作为Ang Ⅱ下游区的因子之一[20],与心肌纤维化的发生有关[21],且HIF-1α与TGF-β1关系密切,可调控TGF-β1的表达[22]。本研究结果也发现:Iso组TGF-β1蛋白表达明显高于空白对照组,而Rapa组中TGF-β1蛋白表达明显降低,同时,其表达与HIF-1α及心肌纤维化程度呈均呈正相关,提示在Iso诱导的心房纤维化过程中,HIF-1α升高引起的TGF-β1表达增加可能是其重要机制之一。
MMP-9作为基质金属蛋白酶家族中的重要一员,与心肌基质的重构有关[23-24],其活性升高可加重心肌纤维化[25],而Ang Ⅱ可使MMP-9的表达增加并参与心房纤维化的形成[25],这与本研究结果相似。TGF-β1与MMPs密切相关,并可在基因水平调控MMP-9的转录[26],诱导其合成[27]。本研究亦发现,Iso组MMP-9蛋白表达明显高于空白对照组,而Rapa组MMP-9蛋白表达明显降低,且其表达与TGF-β1及心肌纤维化程度呈正相关,提示在Iso诱导的心房纤维化过程中,TGF-β1升高引起的MMP-9升高可能是其重要机制之一。
已有研究证实,AF患者心房中HIF-1α水平升高与MMP-9的表达增加有关[28]。本研究中,Iso组HIF-1α及MMP-9蛋白表达均明显增高,二者呈正相关,且与心房纤维化程度亦呈正相关,进一步表明HIF-1α可通过调节MMP-9的表达而参与心肌纤维化的形成,在该过程中,TGF-β1的调节可能发挥着重要作用。
综上所述,本实验结果显示在Iso诱导的心房纤维化模型中,Ang Ⅱ、HIF-1α、TGF-β1及MMP-9均呈高表达,而雷帕霉素可通过抑制HIF-1α的表达而使TGF-β1和MMP-9的表达降低,心肌纤维化程度亦随之减轻,加之它们之间存在上述调控关系,由此可以推断,在Iso诱导的心房纤维化过程中,可能存在Ang Ⅱ/HIF-1α/TGF-β1/MMP-9这样一条信号传导通路,且雷帕霉素具有抗心房肌纤维化的作用,但具体的机制有待进一步研究,而这一结果为AF发病机制的深入研究及AF治疗药物的研发提供了新的方向。
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Expression and its significance of hypoxia-inducing factor-1α in rats with isoproterenol-induced atrial fibrosis
SU Fang-ju1, ZHANG Wei-ze2*, MA Ling2, WANG Fei2, ZHAO Xiao-hua2, AO Xue-ling2, LIU Yan21
Department of Cardiology, Xijing Hospital, Fourth Military Medical University, Xi’an 710032, China
2Department of Cardiology, Lanzhou General Hospital of Lanzhou Command, Lanzhou 730050, China
ObjectiveTo explore the expression of hypoxia-inducing factor-1α (HIF-1α) and its significance in the rats with isoproterenol-induced atrial fibrosis.MethodsThirty male Wistar rats were randomly divided into control group, isoproterenol [Iso, 5mg/(kg.d) for 7 days] group, and Iso + sirolimus (Rapa) group. The atrial fibrosis rat model was reproduced by subcutaneous injection of high doses of Iso in Iso group and Rapa group. Rats were treated with isoproterenol plus sirolimus in Iso-si group. All the animals were sacrificed 15 days after treatment. The contents of angiotensinⅡ(AngⅡ) in rat myocardial tissue were determined by radioimmunoassay. HE staining and Masson staining were performed for the measurement of the degree of atrial fibrosis in terms of collagen volume fraction (CVF). Immunohistochemistry and Western blotting were performed to detect the expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9. The correlations of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 to CVF and expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 were analyzed.ResultsThe AngⅡ content was significantly higher in Iso group and Rapa group than that in control group (P<0.01). No atrial fibrosis occurred in control group (CVF was 15.482%±0.837%), and the atrial fibrosis was significantly milder in Rapa group (CVF was 16.730%±1.052%) than in Iso group (CVF was 86.704%±1.928%,P<0.01). Immunohistochemistry and Western blotting revealed that expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 were significantly increased in Iso group compared with that of control group (P<0.01), but the expressions were significantly decreased in Rapa group compared with that in Iso group (P<0.01). The expressions of HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 were positively correlated with the fibrosis degree (P<0.01); the HIF-1α content was positively correlated with the contents of TGF-β1and MMP-9 (P<0.01); the MMP-9 content was positively correlated with the TGF-β1content (P<0.01).ConclusionAngⅡ, HIF-1α, TGF-β1and MMP-9 play an important role during the development of isoproterenol-induced atrial fibrosis in rats.
hypoxia-inducible factor 1, alpha subunit; heart atria; fibrosis; transforming growth factor β1; matrix metallopmteinases 9
, E-mail: zhangzwz@medmail.com.cn
2013-01-15;
2013-03-25)
(责任编辑:张小利)
苏芳菊,医学硕士,主治医师。主要从事心血管疾病的基础与临床研究
710032 西安 第四军医大学西京医院心内科(苏芳菊);730050 兰州 兰州军区兰州总医院心内科(张卫泽、马凌、王菲、赵小华、敖雪玲、刘燕)
张卫泽,E-mail:zhangzwz@medmail.com.cn
R542.23
A
0577-7402(2013)05-0363-06*