罗格列酮通过激活PPARγ改善肺动脉高压大鼠肺动脉内皮依赖性舒张功能

李 赫， 王东亮， 赵洪文△

(1中国医科大学附属第一医院呼吸病研究所，辽宁沈阳110001;2中国人民解放军第202医院呼吸科，辽宁沈阳110812)

肺动脉高压(pulmonary hypertension，PH)是以肺动脉压力持续增加为特征，表现为右心室后负荷增加和活动耐量下降，多见于慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)、先天性心脏病患者和肺动脉栓塞等［1］。肺血管的舒缩功能异常、血管重构以及动脉内血栓形成是造成肺动脉阻力增加的主要原因，但关于肺动脉高压确切的病理生理机制目前仍未完全阐明［2-4］。有研究表明，肺动脉高压患者肺动脉内过氧化物酶增殖物激活受体γ(peroxisome proliferators-activated receptor γ，PPARγ)的表达显著下降，而PPARγ配体有显著的心血管代谢保护作用，可通过磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)/蛋白激酶 B(protein kinase B，Akt)/一氧化氮(nitric oxide，NO)途径改善血管内皮依赖性的舒张功能，降低血压，同时，还可改善糖、脂代谢等［5］。罗格列酮(rosiglitazone，ROZ)是PPARγ高选择性的激动剂，可通过增加心血管系统NO的生成，改善心血管系统的血管功能，对血管的重塑也有良好的抑制作用［6］。本研究以目前公认的野百合碱(monocrotaline，MCT)诱导的肺动脉高压大鼠模型为基础，从体内及体外两方面探讨罗格列酮对肺血管功能的影响及其作用与PPARγ的关系。

材料和方法

1 主要材料与试剂

1.1 材料 实验均按中华人民共和国卫生部动物实验标准执行。健康清洁级雄性SD大鼠(中国医科大学实验动物中心提供)40只，鼠龄8周，体重290～310 g，常规条件下饲养，自由进食和饮水，适应性喂养1周后进行实验。人肺动脉内皮细胞(human pulmonary artery endothelial cells，HPAECs)购自中国科学院上海细胞库。

1.2 主要仪器与试剂 电子天平(Shangping JA 21002);托盘天平(JA4103型，上海天平仪器厂);小血管张力测定仪(Multi Myograph System，DMT 610M型);显微镜(XYH-3A型，上海永亨光学仪器制造公司);TE2000-U倒置荧光显微镜(Nikon);去离子水过滤器(Minipore);4，5-二氨基荧光素二乙酸酯(4，5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2DA;NO 的荧光探针，Sigma-Aldrich);DMSO(上海生工生物工程有限公司);内皮素-1(endothelin-1，ET-1)和NO ELISA试剂盒(南京建成生物工程研究所);PPARγ的特异性阻断剂GW9662(Sigma);野百合碱(上海融禾医药科技发展有限公司);DMEM培养基(Gibco)。

2 方法

2.1 实验动物分组及模型建立［7］按随机数字表法将40只雄性SD大鼠分为:正常对照组、模型组、罗格列酮组和罗格列酮 +GW9662组，每组10只大鼠。除对照组外，其它各组每只大鼠给予野百合碱60 mg/kg，颈背皮下一次性注射;对照组大鼠仅给予等量生理盐水于颈背部皮下一次性注射。罗格列酮组在注射野百合碱后，每天给予罗格列酮生理盐水混悬液(2.0 mg·kg－1·d－1)灌胃，罗格列酮 +GW9662组在注射百合碱后，每天给予罗格列酮生理盐水混悬液(2.0 mg·kg－1·d－1)+GW9662(0.3 mg·kg－1·d－1)灌胃;对照组及模型组则给予等体积的生理盐水灌胃。

2.2 血浆NO和ET-1的测定 大鼠在干预4周后，禁食24 h，以10%乌拉坦按1 g/kg体重腹腔注射麻醉后，腹主动脉取抗凝血，离心后取血浆以ELISA法测血浆中ET-1和NO含量，操作方法严格按试剂盒说明书执行。

2.3 肺动脉血管环张力实验 大鼠以10%乌拉坦麻醉取血后，打开胸腔，迅速取出双肺，放入冷生理盐溶液(physiological salt solution，PSS)中，在解剖显微镜下小心除去肺动脉周围组织，截取长约2～2.5 mm的肺动脉二级分支。在显微镜下用40 μm的不锈钢丝穿过血管，将带有钢丝的血管环固定在微血管张力测定仪上，并将其放入充满37℃ PSS的浴槽中，浴槽持续通以5%CO2和95%O2的混合气体。在平衡约15 min后利用张力微调旋钮调节初张力并逐渐稳定在2 mN。用KCl(60 mmol/L)刺激血管3次，每次约10 min，在稳定10 min后，用PSS液洗涤3次，每次3～5 min，如此反复3次。PSS配方(mmol/L):NaCl 119，NaHCO325，葡萄糖 11.1，KCl 4.7，KH2PO41.2，MgSO41.2，CaCl22.5，pH 7.4。

乙酰胆碱(acetylcholine，ACh)诱导的血管内皮依赖性舒张反应:以苯肾上腺素(phenyllphrine，PE)10－5mol/L预收缩血管，待血管反应达平台后，加入不同浓度的ACh(10－9～10－5mol/L)，观察血管环的舒张反应。舒张反应功能以ACh的舒张幅度占PE预收缩幅度的百分比表示。

硝酸甘油(nitroglycerin，NTG)诱导的血管非内皮依赖性舒张反应:以PE 10－5mol/L预收缩血管，待血管反应达平台后，加入不同浓度的NTG(10－9～10－5mol/L)，观察血管环的舒张反应。舒张反应以NTG的舒张幅度占PE预收缩幅度的百分比表示。结果以采用GraphPad Prism 3.0软件作图并计算。

2.4 罗格列酮对HPAECs细胞产生NO的影响(1)细胞的培养:HPAECs细胞株用DMEM培养基(含10%胎牛血清、1%链霉素－青霉素溶液)于37℃、5%CO2条件下培养，待细胞完全融合后，用于下列体外细胞实验。(2)NO荧光的测定方法:将105个细胞接种到预先放置2 cm×2 cm无菌盖玻片的6孔板中培养，待细胞贴壁后，加入5 mmol/L DAF-2DA(NO的荧光探针)，37℃避光孵育45 min。用PSS洗涤3次后将盖玻片取出置于荧光显微镜下，在FITC滤光片下用40倍物镜进行照相后用软件进行荧光值测定计算。(3)罗格列酮对HPAECs细胞产生NO的影响:细胞转移至6孔板中，分为对照组、罗格列酮组(浓度为1 μmol/L)和罗格列酮+GW9662组(罗格列酮和GW9662的浓度均为1 μmol/L)，将罗格列酮溶于DMSO中，待细胞于6孔板中贴壁后，给予上述药物干预24 h后进行NO荧光测定。

3 统计学处理

数据采用SPSS 13.0软件处理。数据用均数±标准差(mean±SD)表示。两组间均数比较采用独立样本t检验法，多组间均数比较用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

结 果

1 大鼠的一般情况观察结果

注射野百合碱2周后，部分大鼠开始出现活动迟缓、体重增长缓慢的表现，3周后部分大鼠进食减少，呼吸急促，甚至在口鼻周围出现血性分泌物。实验结束后通过解剖发现多数肺动脉高压大鼠均出现不同程度的胸腔积液，肺部水肿明显，肝脏充血。模型组肺动脉压力 ［(45.11±3.08)mmHg］显著高于对照组［(16.98 ±1.34)mmHg］，差异有统计学意义(P ＜0.01)。

2 罗格列酮对肺动脉高压大鼠血浆NO和ET-1的影响

与正常对照组比较，模型组大鼠血浆中ET-1含量显著增加，而NO含量显著下降，差异有统计学意义(P＜0.01);与模型组比较，罗格列酮干预可显著升高血浆中的NO水平，降低ET-1水平，差异有统计学意义(P＜0.05);但罗格列酮的上述作用在同时给予PPARγ的阻断剂GW9662后被显著减弱，与罗格列酮组比较，差异显著(P＜0.01)，见表1。

表1 罗格列酮对肺动脉高压大鼠血浆ET-1和NO含量的影响Table 1.The effects of rosiglitazone(ROZ)on ET-1 and NO levels in pulmonary hypertensive(PH)rats(mean±SD.n=10)

3 罗格列酮对肺动脉高压大鼠肺动脉血管功能的影响

与正常对照组大鼠比较，模型组大鼠肺动脉血管内皮依赖性舒张功能严重受损，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图1A;而非内皮依赖性舒张功能受损不明显，差异无统计学意义(P＞0.05)，见图1B。与模型组比较，罗格列酮干预可显著改善肺动脉高压大鼠血管内皮依赖性舒张功能，但罗格列酮的作用在给予PPARγ阻断剂GW9662后被显著减弱，差异有统计学意义(均P＜0.05)，见图2。

Figure 1.Comparison of endothelium-dependent(A)and endothelium-independent(B)relaxation of pulmonary arteries between control group and pulmonary dypertension(PH)group.Mean ±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control.图1 模型组与对照组血管舒张功能的比较

Figure 2.Rosiglitazone(ROZ)improved endothelium-dependent relaxation of pulmonary arteries in pulmonary hypertensive(PH)rats.Mean ± SD.n=10.*P ＜ 0.05 vs PH;#P ＜0.05 vs ROZ.图2 罗格列酮改善肺动脉高压大鼠肺动脉血管内皮依赖性舒张功能

4 罗格列酮及GW9662对HPAECs生成NO的影响

与对照组比较，给予罗格列酮孵育后，HPAECs的NO生成量显著增加，荧光强度显著增强，差异有统计学意义(P＜0.01);而同时以罗格列酮和PPARγ阻断剂GW9662孵育后，荧光强度减弱，说明罗格列酮的作用被GW9662显著减弱，罗格列酮组与罗格列酮+GW9662组比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，见图3。

讨 论

Figure 3.Rosiglitazone(ROZ)increased NO production in HPAECs in a PPARγ -dependent manner.Mean ±SD.n=10.＊＊P ＜0.01 vs control;##P ＜0.01 vs ROZ.图3 罗格列酮以PPARγ依赖的方式升高HPAECs中NO的水平

研究表明，在各种诱因下使肺动脉内皮受损是肺动脉高压产生的起始环节［8］，当血管内皮受损后，内皮细胞释放调节血管舒张和防止血管增殖的内皮舒张因子——NO的水平下降，而对血管有强烈收缩作用和促进血管增殖的 ET-1水平则显著上升［9］。因此，外周血循环中NO和ET-1水平可能在一定程度上反映了血管内皮功能［10］。当病因不能去除而持续存在时，如COPD和先天性心脏病，肺动脉就会发生血管重塑和血管舒缩功能的改变［11］，从而导致不可逆的肺动脉高压，乃至出现肺心病和心力衰竭。目前常见肺动脉高压动物模型包括野百合碱注射、慢性低氧、单纯左肺叶切除以及腹主动脉－腔静脉分流等。而由于野百合碱是双吡咯类生物碱，在肝脏内经P450单氧化酶转化后，经血液循环到达肺脏，能够选择性损伤肺血管内皮，引起慢性血管炎性病变，更接近临床发病的机制;加上该造模方法成功率高、操作简便、重复性好而较为广泛应用［7，12］。在本实验中，我们以野百合碱皮下注射成功地复制出大鼠的肺动脉高压模型，大体表现为大鼠出现胸腔积液，肺部水肿明显，肝脏充血以及镜下的肺血管重塑以及血管周围炎症浸润。在此基础上，本研究发现，肺动脉高压大鼠模型组大鼠血浆中ET-1含量显著增加，而内源性的NO含量显著下降，提示血管内皮功能严重受损;而罗格列酮可显著升高肺动脉高压大鼠血浆NO的水平，降低ET-1的水平，表明罗格列酮可能具有改善肺动脉高压大鼠肺动脉内皮功能的作用。NO通过激活鸟苷酸环化酶，升高环磷酸鸟苷(cyclic guanosine monophosphate，cGMP)含量，降低细胞内钙水平，促使肌球蛋白轻链脱磷酸化，导致平滑肌松弛，血管舒张。而内源性NO是由内皮型NO合酶催化L-精氨酸与氧结合后释放的［13］。在血管内皮细胞存在时，乙酰胆碱可以促进血管内皮释放NO，因此，乙酰胆碱对血管的舒张作用依赖于内皮的存在，在病理状态下，如高血压、动脉粥样硬化，血管内皮明显受损的情况下，乙酰胆碱诱导的血管舒张反应会明显下降。硝酸甘油为NO的直接供体，其舒张血管的作用不依赖于血管内皮的存在，为非内皮依赖性血管舒张剂［14］。在本研究中，罗格列酮可改善乙酰胆碱诱导的血管舒张反应，而对于硝酸甘油诱导的血管舒张反应，各组间无显著差异，说明罗格列酮改善肺动脉高压大鼠肺动脉血管舒张功能是血管内皮依赖性的。

近年的研究结果表明PPARγ的受体激动剂具有显著的心血管代谢保护作用，PPARγ受体激动剂通过PI3K/Akt/NO信号通路可显著改善血管内皮依赖性舒张功能［3］。研究还表明PPARs(包括PPARγ，PPARδ等)与肺动脉高压的发生、发展有密切的关系，在肺动脉高压的肺组织中，PPARγ蛋白表达显著下降［15-16］。亦有研究表明 PPARγ激活后可抑制血管的重塑［6］，但PPARγ激动剂是否对肺动脉高压具有防治作用则未见确切的具体报道。目前已证实，罗格列酮是PPARγ的激动剂［17］。本研究发现，罗格列酮可显著增加HPAECs的NO生成，而PPARγ阻断剂GW9662可显著阻断罗格列酮的作用。以上研究结果提示:罗格列酮改善肺动脉高压大鼠肺血管内皮依赖性舒张功能的作用可能是通过激活PPARγ受体减少ET-1的生成，增加肺动脉内皮细胞NO的产生而起作用的。

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