棉籽蛋白源ACE抑制肽的制备过程中脱盐技术的研究

刘 军 徐志宏 魏振承 廖森泰 穆利霞

(广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所，广东省农产品加工重点实验室，广州 510610)

棉籽蛋白是一种仅次于大豆蛋白的优质植物蛋白，其营养价值高于禾谷类蛋白，含有小麦、稻米等谷类作物所欠缺的必需氨基酸，除蛋氨酸稍低外，其余氨基酸均达到联合国粮农组织(FAO)推荐的标准［1］。但是棉籽蛋白的结构紧密，分子质量大，人体摄入后不易消化吸收，因而一直没有得到充分的利用。棉籽蛋白经水解成肽后，分子质量减小，结构疏松，便于人体内酶的进攻，吸收率大大提高［2］。因此，开发棉籽系列功能性活性肽产品有着重大的现实意义。

棉籽蛋白在酶水解过程中，需要不断加入碱液来维持反应体系的pH值，导致水解液中残留了大量的无机盐，影响了产品的生物活性和性质，也不利于对其进一步的分析，因此有必要对酶解液进行脱盐纯化处理，以提高棉籽多肽的生物活性。目前报道的酶解液脱盐效果比较好的主要有001×7、201×7型阴阳离子交换树脂、MWCO100透析袋和DA201－C型大孔吸附树脂脱盐。但这几种脱盐方法各有优劣，对不同来源的蛋白水解液脱盐效果也各不相同。本试验比较了3种具有代表性的脱盐方法的优劣，研究了棉籽蛋白酶解降压肽脱盐方法的最佳工艺，探讨脱盐纯化工艺对棉籽蛋白酶解液的ACE抑制活性和氨基酸组成的影响，并对Sephadex G－25葡聚糖凝胶色谱分离纯化获得棉籽肽各组分进行ACE抑制活性测定，确定活性组分的分子质量分布范围，从而为棉籽蛋白酶解制备ACE抑制活性肽提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

棉籽分离蛋白(CPI):自制，蛋白质量分数90.78%，棉酚含量 17.6 mg/kg;碱性蛋白酶(Alcalase)、胰蛋白酶、复合风味蛋白酶(Flavourzyme):丹麦诺维信(Novozymes)公司;离子交换树脂001×7、201×7:广州金东方树脂化工有限公司;MWCO100透析袋:北京中西化玻仪器有限公司;DA201－C大孔吸附树脂:江苏苏青水处理工程集团有限公司;血管紧张素转化酶(ACE)、马尿酰组氨酰亮氨酸(HHL)、标准品牛血清白蛋白、溶菌酶、VB12和L－酪氨酸:美国sigma公司。

1.2 仪器

SHA－B水浴恒温振荡器:常州澳华仪器有限公司;PHS－3C型酸度计:上海雷磁仪器厂;KDN－08A半自动凯氏定氮仪:上海新嘉电子有限公司;LD－5－A型离心机:上海安亭科学仪器厂;UV－1800紫外可见光分光光度计:岛津分析仪器;5200电导率仪:上海自动化仪表有限公司;HL－1B数显恒流泵:上海沪西分析仪器有限公司;SBS100数控计滴自动部份收集器:上海沪西分析仪器有限公司;Agilent 1100系列液相色谱仪:安捷伦液相色谱仪公司。

1.3 测定方法

1.3.1 含氮量的测定:微量凯氏定氮法

1.3.2 含盐量的测定:莫尔法［3］

以K2CrO4为指示剂，用AgNO3标准溶液进行滴定。由于AgCl沉淀的溶解度小于Ag2CrO4沉淀，因此溶液中首先析出AgCl沉淀，当溶液中的氯化物与AgNO3完全作用后，过量的AgNO3立即与K2CrO4反应生成砖红色的Ag2CrO4沉淀，指示到达终点。用已知浓度的AgNO3溶液测定Cl－浓度，即可获得氯化钠盐的含量，再按下式计算脱盐率:

1.3.3 ACE 抑制率测定

参照Cushman等［4］的方法，有所修改。按照表1将各试剂加入到试管中，在37℃水浴中反应30 min，反应结束后马上加入1 mol/L的HCl以终止反应(样品c需提前加入HCl);然后于各试管中加入乙酸乙酯 1.5 mL，混合后进行离心(4 000 r/min，10 min)，吸取1 mL乙酸乙酯层于另一试管中，放入烘箱中120℃挥发溶剂35 min，拿出冷却后加入去离子水3 mL漩涡混合后在228 nm下测定吸光值，计算公式为:

式中:Aa为ACE和ACE抑制剂同时存在的吸光值;Ab为不加抑制剂的吸光值;Ac为ACE与HHL空白反应的吸光值。

1.3.4 氨基酸分析

采用HPLC法，样品按GB/T 18246—2000酸水解处理，按JY/T 024—1996测定。

1.4 试验方法

1.4.1 棉籽蛋白水解液的制备流程［5］

称取一定量的棉籽分离蛋白(经过脱除棉酚处理)，加水配制成悬浮液，调节体系温度和pH至酶作用最适条件，加碱性蛋白酶和胰蛋白酶复合水解，采用pH－stat装置控制反应体系的pH值在±0.05之内，并不停的震荡搅拌，以便水解反应均匀、充分。反应一段时间后再加风味酶继续水解一定时间，然后加热灭酶(90℃，10 min)即得酶解液。酶解液离心(4 000 r/min，20 min)后的上清液进行分离纯化。

1.4.2 脱盐方法

本试验综合比较了3种方法对棉籽蛋白水解液进行脱盐:

方法1(阴阳离子交换树脂脱盐):将处理过的阴阳离子交换树脂装柱，样品先后通过强酸性阳离子交换树脂001×7和强碱性阴离子交换树脂201×7，用去离子水作洗脱剂，通过不同流速收集最后流出液，测定含盐量和含氮量，计算脱盐率和氮回收率。

方法2(透析袋脱盐):将样品装入处理过的MWCO100的透析袋中，浸泡在去离子水中于4℃下透析，每4小时换一次水，24、48 h后测定水解液的含盐量和含氮量，计算脱盐率的氮回收率。

方法3(大孔树脂脱盐):样品溶液流过DA201－C大孔吸附树脂层析柱(2.6 cm×30 cm)，控制体积流量，检测流出液的，以=0.05为透过点。试验中所用样品的体积均小于透过点通液量，用去离子水以同样流速洗柱至流出液的电导率与去离子水一致，再用75%乙醇解吸，通过不同流速收集最后流出液，减压浓缩蒸去乙醇加去离子水定容测含氮量。计算脱盐率和氮回收率。

脱盐率=(水清洗液中Cl－浓度×水洗液体积)/(吸附前样品溶液中Cl－浓度×上样体积)×100%

氮回收率=(解吸后N浓度×定容体积)/(吸附前样品N浓度×上样体积)×100%

1.4.3 标准洗脱曲线方程的获得

将己知分子量标准品牛血清白蛋白(M r=6.7×104)、溶菌酶(M r=1.44 × 104)、VB12(M r=1.37 ×103)和L－酪氨酸(M r=181.2)配成一定浓度的溶液，经针式微孔膜过滤后上样过Sephadex G－25，上样量为1.0 mL，得标准物质洗脱曲线。然后以分子量的对数为横坐标、洗脱管数(保留时间)为横坐标作图，得标准物质洗脱曲线方程Y=－5.364 4X+64.035(R2=0.998 5)。

2 结果与分析

2.1 离子交换树脂处理对脱盐效果的影响

阴阳离子交换树脂脱盐主要是根据氨基酸与苯乙烯系强酸性阳离子交换树脂之间既存在离子间的静电作用，又存在疏水作用，且二者之间存在协同作用，用水作为洗脱剂，使盐和氨基酸得到分离［6］。此方法脱水解液中的盐简单易行，用水作为洗脱剂既廉价又不造成污染，树脂再生即可重复使用。在保持室温的条件下，考察了不同流速对脱盐效果的影响，结果如图1所示。

图1 不同流速离子交换树脂的脱盐效果

由图1可知，不同的流速脱盐对氮回收率及脱盐率都有影响。流速越大，脱盐率和氮回收率也随之降低。离子交换树脂的脱盐率很高，但氮的回收率太低，不足10%，在实际工业生产中远远达不到要求。因此，选用阴阳离子交换树脂对棉籽蛋白水解液脱盐处理不合适。

2.2 透析对脱盐效果的影响

考虑到棉籽蛋白水解液和盐分之间分子质量存在较大差异，用截留分子质量为100 u的透析袋对水解液精致处理，结果如图2所示。

图2 不同透析时间的脱盐效果

由图2可知，透析时间与脱盐率和氮回收率之间存在量效关系。透析48 h后，脱盐率可达61.40%，此时氮回收率为51.40%。相对来说，透析脱盐的方法简单易行，脱盐效果较好，但操作量小，耗时时间长，仅限于实验室操作，不适合工业上的大规模生产。

2.3 大孔吸附树脂处理对脱盐效果的影响

大孔吸附树脂脱盐是根据化合物的疏水基团与树脂的非极性吸附剂之间的范德华引力和静电引力来达到分离水溶性化合物。多肽可以从水相中通过疏水作用吸附到树脂的疏水表面和网络空穴内部，从而与盐类分离，再通过合适浓度的乙醇洗脱就可以回收多肽［7］。考察了1.5、3、6 mL/min 3 种流速对脱盐效果的影响，结果如图3所示。

图3 不同流速大孔吸附树脂的脱盐效果

由图3可知，流速不同对氮的回收有很大影响，流速越大，造成的氮损失越多，多肽回收率降低;流速不同对脱盐率的影响不显著，而且脱盐率都在90%以上。在实际的工业生产中要考虑到缩短生产周期和较高的蛋白回收率，选用流速3 mL/min较为合适，其氮的回收率相比流速1.5 mL/min并没有显著降低，但周期缩短1倍，更利于工业化大生产，且树脂的吸附能力没有降低。

2.4 大孔树脂脱盐对棉籽蛋白ACE抑制肽的影响

用脱盐率、氮回收率和ACE抑制率为指标考察DA201－C大孔吸附树脂对棉籽蛋白水解液的脱盐效果，分析结果见表2。

表2 DA201－C树脂脱盐前后比较

从表2来看，流速为3 mL/min的脱盐效果非常明显，脱盐率达到94.78%，氮回收率86.32%，而且脱盐后ACE抑制率显著提高，半抑制浓度 IC50从0.486 mg/mL 下降到0.328 mg/mL。

2.5 大孔树脂脱盐对棉籽蛋白水解液氨基酸组成的影响

对脱盐前后的棉籽蛋白酶解液进行氨基酸组成分析，结果见表3。从表3可以看出，棉籽蛋白水解液中含有丰富的 Asp，Glu，Arg，Phe，Leu 等必需氨基酸，是一种优质的植物蛋白肽。经过DA201－C大孔吸附树脂处理后，水解液中的 Tyr，Phe，Ile，Leu，Lys等疏水性氨基酸得到了有效富集，这是因为部分亲水性氨基酸未完全被大孔树脂吸附而流失［8］，而具有吲哚环的Try(未检测)或苯环的Tyr和Phe可以被树脂强烈吸附，具有较长脂肪族侧链的氨基酸Leu、Ile和具有琉基的Met(含量太低)也可被充分吸附［9］，从而使得疏水性氨基酸得到了富集，脱盐后疏水性氨基酸大幅度增加，其总和所占比例是脱盐前的近2倍。

ACE抑制活性肽都含有丰富的疏水性氨基酸［10］。棉籽多肽中含有较多的疏水性肽段，因而其具有很好的ACE抑制活性，而且这些疏水型氨基酸能很好地被DA201－C大孔吸附树脂吸附而得到富集，从而进一步提高了棉籽蛋白水解液的ACE抑制活性。

表3 棉籽蛋白水解液脱盐前后的氨基酸组成分析/mg/g蛋白质

从表3还可以看出，脱盐后水解液中Tyr和Phe含量增幅最大，达到2倍以上，这正符合ACE抑制活性肽模型相符［11］，该模型认为疏水性氨基酸残基占60%以上，且末端的氨基酸种类如果是芳香族氨基酸或疏水性氨基酸残基，则与血管紧张素转换酶结合能力强，降压活性高，这也是棉籽蛋白水解液脱盐后ACE抑制活性提高的另一个原因。

2.6 Sephadex G－25分离纯化ACE抑制肽

凝胶过滤层析技术可分离分子质量大小不同的蛋白质并测定其分子质量。Sephadex G－25分离范围是1 000～5 000 u，适用于脱盐、肽与其他小分子的分离。对脱盐后的棉籽蛋白水解液采用Sephadex G－25分离纯化，如图4所示:共有7个峰出现，前面的3个峰属于蛋白峰，不予以考虑。将后4个峰依次命名为峰Ⅰ(39～43管)、峰Ⅱ(44～49管)、峰Ⅲ(50～54管)和峰Ⅳ(55～61管)，可以分成4个组分。同时可以看出，棉籽蛋白酶解物分子质量是连续分布的，即水解物中存在着各种大小不等的肽分子，结合标准物质洗脱曲线方程可知大部分棉籽肽分子质量分布在13 000 u以下。

图4 棉籽蛋白酶解物的凝胶过滤层析洗脱图

2.7 各组分的ACE抑制活性比较研究

把收集到的各管洗脱液按各组分合并，定量后比较ACE活性的抑制率，结果如图5。由图5可知，各组分对ACE的抑制率差异较大。组分Ⅲ的抑制率最高，达到83.63%，其次是组分Ⅱ，为62.75%，最差的是组分Ⅰ和Ⅳ，分别为32.81%和28.52%，结合标准物质洗脱曲线方程粗略发现，组分Ⅲ的分子质量小于1 ku，说明小分子质量的棉籽短肽的ACE抑制活性最高，这与Miguel等［12］的结论是一致的。

图5 各组分的ACE抑制活性

3 结论

3.1 大孔吸附树脂对棉籽蛋白水解液脱盐简单可行，在流速为3 mL/min时，脱盐率可达到94.78%，氮回收率为86.32%;比较脱盐前后的疏水性氨基酸变化，发现脱盐后疏水性氨基酸(特别是Tyr和Phe)得到有效富集，ACE抑制率显著提高，半抑制浓度IC50从0.486 mg/mL 下降到 0.328 mg/mL。由于大多数的生理活性肽的生理活性都与其疏水性有关，因而采用DA201－C大孔吸附树脂吸附脱盐可望成为一种有效分离纯化活性肽的方法。

3.2 DA201－C大孔吸附树脂脱盐纯化后疏水性氨基酸得到了有效富集，ACE抑制率显著提高。分离纯化后的ACE抑制肽各组分中，组分Ⅲ的抑制率最高，分子质量小于1 000 u的短肽。

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