晚期氧化蛋白产物对人巨噬细胞产生NO、ROS的影响及复方黄甘提取物的干预

毛 萍， 莫立乾， 肖小燕， 宋少练， 杨西晓

(南方医科大学南方医院药学部，广东广州510515)

1996 年Witko-Sarsat等［1］首先报道，晚期氧化蛋白产物 (Advanced oxidation protein products，AOPP)系因患者体内过高的氧化应激水平导致各种蛋白质氧化损伤所形成的终末产物的总称。血浆晚期氧化蛋白产物水平增高促使该分子在肾脏和血管等组织中沉积，通过促发炎症正反馈导致单核细胞持续活化，从而参与全身性炎症反应的发生和发展，与慢性肾病的进展及动脉粥样硬化病变的发生发展密切相关。活性氧 (ROS)是一类具有高度反应活性的含氧化合物总称，当ROS产生过多超出了机体的清除能力和/或机体抗氧化能力下降不能及时清除机体内产生的ROS时，机体就会产生氧化应激损伤［2-3］。一氧化氮 (NO)是一种极不稳定的生物自由基，当其作用于蛋白，脂质，核酸等可以引起细胞结构和功能的改变［4］。它介导的生物学作用包括扩张血管、神经传递，抑制血小板聚集、激活内皮细胞、炎性反应、脱噬作用、神经传递、抗病原体和抗肿瘤［5-7］。Zhou等［8］报道晚期氧化蛋白产物水平的增高促进炎症反应;Kishimoto等［9］报道巨噬细胞在炎症反应介导的细胞增殖方面发挥重要作用，张志辉等［10］发现晚期氧化蛋白产物可通过激活单核细胞释放ROS，李忠海等［11］发现晚期氧化蛋白产物能抑制小鼠腹腔巨噬细胞诱导型一氧化氮的产生，但晚期氧化蛋白产物对人巨噬细胞有何影响还不甚明了。

复方黄甘颗粒是我院研制出的防治慢性肾衰(CRF)的纯中药制剂中成药，它的主要成分有大黄、甘草等。本实验室曾报道［12］该药可降低血清肌酐、尿素氮，延缓肾衰进展。进一步的实验［13］证实复方黄甘提取物可显著降低慢性肾衰模型动物体内的晚期氧化蛋白产物水平。因此推测复方黄甘提取物对晚期氧化蛋白产物有一定的清除能力或可逆转晚期氧化蛋白产物对机体的不良作用。但对其发生作用的途径和机理尚不清楚。因此，本实验旨在研究复方黄甘提取物对晚期氧化蛋白产物诱导的人单核细胞 (THP-1)源性巨噬细胞产生NO和ROS的影响及可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 试剂 THP-1细胞株购自中国科学院上海细胞生物研究所;无内毒素牛血清白蛋白 (BSA)、四甲基偶氮唑蓝 (MTT)、2，7-二氢二氯荧光素二酯 (DCFH-DA)、PMA(佛波醇酯)均购自sigma公司;RPMI1640培养基、胎牛血清购自Gibco公司;复方药材均购自广东康美药业，均由南方医科大学中药鉴定教研室张宏伟教授鉴定;Trizol试剂盒和RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司，PCR引物合成 (Invitrogen公司)，其余为国产分析纯。

1.2 仪器 1285型CO2细胞培养箱 (美国Thermo公司);BX51正置荧光显微镜及照相系统 (日本Olympus公司);SpectraMax M5多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司);RE—52A旋转蒸发仪 (巩义市予华仪器有限公司);ZK—828型真空干燥箱 (上海实验仪器总厂);5810R低温离心机 (德国Ependorf公司);SB25—12YDTD超声波清洗器 (宁波新芝生物科技有限公司);ABI 7500荧光定量PCR仪 (美国)。

1.3 实验方法

1.3.1 复方黄甘提取物的制备 复方黄甘颗粒全方药材加十倍量水，煎煮两次，每次1.5 h弃渣收集提取液，并将其浓缩至1∶2(mL∶g)，药液放冷后边搅拌边缓慢加入乙醇使其达80%含醇量，密闭冷藏24 h，滤过，滤液旋转蒸发去除大部分乙醇，再60℃真空干燥得复方黄甘水提醇沉部分干浸膏，用DMSO溶解配制成母液，待实验时用完全培养基配制成相应质量浓度。

1.3.2 无内毒素晚期氧化蛋白产物的制备与鉴定晚期氧化蛋白产物的制备参考Witko-Sarsat等［14］介绍的经典方法:将无内毒素的BSA(20 g/L)与次氯酸钠40 mmol/L以1/140的等摩尔比例混合均匀，室温反应30 min，制备出晚期氧化蛋白产物，其在无菌PBS(pH 7.4)中4℃透析24 h，以除去游离的次氯酸钠，过滤除菌后4℃保存备用。按照Witko-Sarsat等［1］的紫外分光光度计法，于酸性条件下、340 nm测定晚期氧化蛋白产物制品和对照BSA样品中晚期氧化蛋白产物的浓度，以氯胺-T为标准品，实际测定的为晚期氧化蛋白产物对氯胺-T的相对浓度;Bradford法于595 nm处测定晚期氧化蛋白产物制品和对照BSA样品中总蛋白的量 (g/L);应用凝胶法鲎试剂 (灵敏度0.25 EU/mL)定性检测晚期氧化蛋白产物制品中内毒素的量。

1.3.3 THP-1源性巨噬细胞的诱导分化和分组用10%FBS的RPMI1640培养液常规培养THP-1细胞，以160 nmol/L的PMA刺激THP-1细胞24 h［15］后使之分化为巨噬细胞。以100 mg/L的晚期氧化蛋白产物与人巨噬细胞共同培养，复方黄甘提取物不同质量浓度干预处理。

1.3.4 细胞活性的测定 用MTT还原法测定细胞活性。人巨噬细胞以5×104个细胞/mL密度接种到96孔板内，每孔100μL，与晚期氧化蛋白产物共同培养24 h，再加入复方黄甘提取物继续培养24 h，培养结束后加入MTT 20μL/孔，继续培养4 h后弃上清，加入DMSO溶液150μL/孔，室温震荡10 min，于多功能酶标仪570 nm处测定吸光度OD值。

1.3.5 NO的测定 以100 mg/L的1/140修饰程度的晚期氧化蛋白产物与人巨噬细胞共同培养于96孔板中24 h，每孔1×106个细胞，复方黄甘提取物不同质量浓度 (100、200、400 mg/L)继续培养24 h，用Griess试剂法测定培养上清亚硝酸盐的量，间接反映NO的产生量即取培养上清液100 μL，加入等量 Griess试剂 (1% 对氨基苯磺酸，0.1%N-萘基乙二胺，2.5% 磷酸溶液)，室温反应10 min，于550 nm处测OD，以NaNO2为标准品绘制标准曲线。

1.3.6 iNOSmRNA表达水平的测定 以100 mg/L的1/140修饰程度的晚期氧化蛋白产物与人巨噬细胞共同培养于6孔板中24 h，复方黄甘提取物不同质量浓度 (400 mg/L)继续培养24 h，RT-PCR测定iNOSmRNA的表达水平。iNOS引物序列:上游引 物 5'-CCAAGAGAAGAGAGATTCCATTGAA-3'，下游引物5'-TGATTTTCCTGTCTCTGTCGCA-3';βactin引物序列:上游引物5'-CTTCTACAATGAGCTGCGTG-3'，下 游 引 物 5'-CATGAGGTAGTCAGTCAGG-3'。

1.3.7 细胞内活性氧 (ROS)的测定 以100 mg/L的1/140修饰程度的晚期氧化蛋白产物与人巨噬细胞共同培养24 h，复方黄甘提取物不同质量浓度(100，200，400 mg/L)继续培养24 h，培养结束后用对ROS敏感的荧光探针DCFH-DA标记细胞，用多功能酶标仪在λex=485 nm、λem=535 nm下测定细胞经不同刺激后细胞内氧化DCFH产生的荧光量，即细胞内活性氧的产生量。

1.3.8 抑制剂的阻断实验 用NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸盐 (PDTC，10μmol/L)、NADPH氧化酶抑制剂二亚苯基碘 (DPI，100μmol/L)和复方黄甘提取物 (400 mg/L)分别预处理细胞1 h，再用晚期氧化蛋白产物刺激，24 h培养结束后用荧光探针DCFH-DA标记细胞，测定细胞内活性氧的产生量;培养上清用ELISA法测定TNF-α、IL-1β和IL-6的分泌量;RT-PCR测定TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平。TNF-α基因引物序列 (上游5'-TGGAGAAGGGTGACCGACTC-3'，下 游 5'-TCCTCACAGGGCAATGATCC-3');IL-1β基因引物序列 (上游 5'-CTGTACGATCACTGAACTGC-3'，下游 5-CACCACTTGTTGCTCCATACT-3');IL-6基因引物序列(上游 5'-GGTACATCCTCGACGGCATC-3'，下游 5'-GCCTCTTTGCTGCTTTCACAC-3')。

2 结果

2.1 晚期氧化蛋白产物制品的测定 1/140修饰程度的晚期氧化蛋白产物制品及未修饰的BSA中的晚期氧化蛋白产物的量分别为1 047.76μmol/L，20.58μmol/L，其制品与未修饰的BSA的水平比较有显著性差异 (P＜0.01)，说明晚期氧化蛋白产物制备成功;晚期氧化蛋白产物蛋白质量浓度为12.04 g/L，而且该制品及未修饰的BSA的细菌内毒素水平均低于0.25 EU/mL。

2.2 THP-1源性巨噬细胞的诱导分化 THP-1单核细胞株经160 nmol/L PMA刺激诱导分化24 h后，其细胞形态由原来的悬浮生长，呈球状，胞浆透澈转变为THP-1源性巨噬细胞，呈贴壁生长，椭圆状或梭形，部分伸出伪足，胞浆内有颗粒状物质，表明THP-1源性巨噬细胞诱导成功。

2.3 细胞活性的测定 将复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h后用MTT法测定其细胞活性，结果显示复方黄甘提取物在10～500 mg/L质量浓度范围内对人巨噬细胞的活性无显著影响(P＞0.05)，见图1。

2.4 复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h对人巨噬细胞产生NO的影响 巨噬细胞产生的NO是杀灭病原微生物和肿瘤细胞的一道初级防线，可以诱导人巨噬细胞的凋亡。为了研究复方黄甘对晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞产生NO的影响，将复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h，测定其培养上清NO的产生量。图2显示晚期氧化蛋白产物抑制人巨噬细胞产生NO(P＜0.05)，给予复方黄甘提取物处理后可显著性诱导NO的产生 (P＜0.01)，且随质量浓度的增加而增加。

图1 复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h对人巨噬细胞的活性影响 (n=6，±s)Fig.1 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the cell viability in macrophages(n=6，±s)

图2 复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h对人巨噬细胞产生NO的影响 (n=6，±s)Fig.2 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the NO level in macrophages(n=6，±s)

2.5 复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h对人巨噬细胞产生ROS的影响 复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h，测定ROS的产生量。图3显示复方黄甘提取物可显著性抑制晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞产生ROS(P＜0.01)，其抑制程度呈质量浓度依赖性。

图3 复方黄甘提取物与晚期氧化蛋白产物共培养24 h对人巨噬细胞产生ROS的影响 (n=6，±s)Fig.3 Effect of different concentrations of Compound Huanggan Extract cultured for 24 h by advanced oxidation protein products on the reactive oxygen level in macrophages(n=6，±s)

2.6 抑制剂预处理人巨噬细胞对其活性氧及细胞因子的影响 用NF-κB抑制剂PDTC、NADPH氧化酶抑制剂DPI和复方黄甘提取物预处理细胞1 h，再用晚期氧化蛋白产物刺激，24 h培养结束后测定活性氧量的变化，图4A显示两种抑制剂均能显著性抑制晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞ROS的产生 (P＜0.01)，复方黄甘提取物也能显著性抑制ROS的产生 (P＜0.01)，抑制程度弱于DPI和PDTC抑制剂;图4B～4D ELISA法显示3种物质均能显著性抑制TNF-α、IL-1β和IL-6 3种细胞因子的蛋白表达，复方黄甘提取物的抑制程度稍弱。图5考察了复方黄甘提取物对晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞产生ROS的时间质量浓度依赖性。结果表明当用复方黄甘提取物 (100～400 mg/L范围)预处理时间为0.5 h时，其抑制ROS的程度在200 mg/L达到平台期;当预处理时间为1 h时，其抑制ROS的程度呈现一定的质量浓度依赖性。

图4 DPI、PDTC和复方黄甘提取物对晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞ROS(A)(n=6)、TNF-α蛋白 (B)(n=3)、IL-1β蛋白 (C)(n=3)、IL-6蛋白 (D)(n=3)的影响(±s)Fig.4 Effect of DPI，PDTC，Compound Huanggan Extract on advanced oxidation protein products-induced ROS(A)(n=6)and TNF-α (B)(n=3)，IL-1β (C)(n=3)and IL-6(D)(n=3)secretion in THP-1 macrophages(±s)

图5 复方黄甘提取物预处理不同时间对晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞 ROS产生的影响 (n=6，±s)Fig.5 Effect of Compound Huanggan Extract by different pre-treatment time on advanced oxidation protein products-induced ROS production in THP-1 macrophages(n=6，±s)

2.7 RT-PCR测定复方黄甘提取物对人巨噬细胞iNOS、TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达水平的影响 图6A显示复方黄甘提取物可显著性上调晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞iNOS mRNA的表达水平。图6B～6D表明可显著性下调晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA的表达水平，其结果与ELISA法测定的蛋白水平一致。

3 讨论

图6 复方黄甘提取物对晚期氧化蛋白产物诱导人巨噬细胞iNOS m RNA(A)、TNF-αmRNA(B)、IL-1β m RNA(C)、IL-6 mRNA(D)表达的影响(n=3，±s)Fig.6 Effect of Compound Huanggan Extract on advanced oxidation protein products-induced iNOS mRNA(A)，TNF-α m RNA(B)，IL-1β mRNA(C)and IL-6 mRNA(D)in THP-1 macrophages(n=3，±s)

晚期氧化蛋白产物是一种炎症介质，单核/巨噬细胞是其选择性作用的靶细胞。本实验研究发现复方黄甘提取物能够显著性增加晚期氧化蛋白产物诱导巨噬细胞分泌NO且呈一定的质量浓度依赖性，是通过上调诱导型一氧化氮合酶的表达而达到的。复方黄甘提取物激活了NO介导的抗增殖效应，抑制巨噬细胞在病灶处的增殖和聚焦，从而减轻病灶局部的微炎症反应。RT-PCR法和ELISA法均表明复方黄甘提取物可以下调晚期氧化蛋白产物诱导巨噬细胞产生的细胞因子 TNF-α、IL-1β和IL6，进一步减轻了炎症反应。晚期氧化蛋白产物不仅是次氯酸氧化白蛋白的产物，即氧化应激介导蛋白损伤的标志物，又进一步激活巨噬细胞产生活性氧，形成氧化应激的恶性循环。给予复方黄甘提取物处理后，其能显著性抑制晚期氧化蛋白产物诱导巨噬细胞产生ROS的水平，且呈一定的质量浓度依赖性，说明复方黄甘提取物能消除已产生的ROS;当用复方黄甘提取物预处理巨噬细胞后，ROS的水平也显著性降低，其降低程度稍弱于NADPH氧化酶抑制剂DPI和NF-κB抑制剂PDTC。由此可以推测复方黄甘提取物能够直接消除ROS，也可能通过抑制NADPH酶的活性，或者阻断NF-κB信号通道来达到消除ROS，从而减轻氧化应激损伤。进一步提出复方黄甘提取物可能通过减轻氧化应激损伤和改善免疫功能紊乱来延缓慢性肾衰的进程。但复方黄甘提取物影响ROS产生的机制还有待进一步实验探讨。

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