葛根芩连汤及不同配伍对肝细胞色素P450酶的影响

陈 烨， 袁 瑾， 王新宏， 安 叡， 肖 娟， 张宜凡

(上海中医药大学，上海201203)

细胞色素P450(CYP450)酶系是参与各种体内药物代谢的重要组成部分。该酶可被药物等外源物诱导或抑制，导致其水平和活性的改变，从而直接影响药物在体内的血药浓度、动力学变化以及后续生物学效应。CYP450酶检测主要有体内和体外两种方法［1］，Cocktail探针药物法是最常用的体内检测法。它可以同时评价几种药物代谢酶的活性，即给予多种相对低剂量的探针药物，通过检测生物样本中每种探针药物的血浆动力学从而获取多个代谢酶的活性信息［2-4］。利用Cocktail探针药物法测定催化特定底物的CYP450酶活性，可用于分析比较药物不同配伍关系中酶活性的差异［5］。

葛根芩连汤出自张仲景的《伤寒论》，由葛根、黄芩、黄连及炙甘草四味中药组成［6］，方中葛根为君药，黄芩、黄连 (芩连)为臣药，炙甘草为佐使药。组方精简，配伍严谨。现代临床应用广泛，常用于急、慢性肠炎、细菌性痢疾、II型糖尿病、小儿腹泻等阳明里热证［7-8］。本实验采用Cocktail探针药物法，选择咖啡因［9］、甲苯磺丁脲［10］、右美沙芬［11］、氯唑沙宗［12］和咪达唑仑［9］分别作为 CYP1A2、CYP2C6、CYP2D4、CYP2E1和CYP3A1/2 5种不同亚型酶的探针底物，研究葛根芩连汤全方及其不同配伍对5种亚型酶活性的作用，探寻其不同配伍对CYP450酶活性的影响，希冀为深入研究葛根芩连汤组方原理、配伍合理性和科学性奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 SHIMADZU高效液相色谱仪，包括自动进样器、真空脱气机 (日本岛津公司);三重四级杆质谱仪，包括 ESI离子源和 Analyst version 1.4.2色谱工作站 (API 3000，AB，U．S．A);氮吹仪 (上海安谱科学仪器);Eppendorf Cen ANPEL DC-1trifuge 5415R小型高速冷冻离心机 (艾本德中国有限公司);AL104电子天平 (瑞士梅特勒-托利多仪器有限公司);QT—1漩涡混合器 (上海琪特分析仪器有限公司)。

1.2 药品与试剂 对照品:甲苯磺丁脲 (tolbutamide)(批号100500-201001)、右美沙芬 (dextromethorphan) (批号100201-201003)、氯唑沙宗(chlorzoxazone)(批号100364-201001)、卡马西平(carbamazepine)(批号100142-201004)、氯霉素(chloramphenicol)(批号130555-201002)均购自中国食品药品检定研究院;咖啡因 (caffeine)(批号201004)、咪达唑仑 (midazolam) (批号201001)均购自上海瑞齐生物科技有限公司。

试剂:乙腈、甲醇和甲酸均为HPLC级 (美国Merck公司)，乙酸乙酯、无水乙醇和乙酸铵 (AR级)购于国药集团化学试剂有限公司;双蒸水，实验室自制。

1.3 药材 葛根饮片Puerariae lobatae Radix，四川 (批号20100525);黄芩饮片Scutellariae Radix，河北 (批号20100805);黄连饮片Coptidis Rhizoma，四川 (批号20100720)，以上饮片均购于上海康桥中药饮片有限公司。炙甘草饮片Glycyrrhizae Radix et Rhizoma preparatum cum melle，新疆 (批号20100705)，购于上海金桥养和堂药店。上述饮片经陈燕军主管药师鉴定，符合2010版《中国药典》一部规定。

1.4 动物 清洁级SD大鼠，体质量 (200±20)g，雄性，合格证号:SCXK(2008-0016)，由上海中医药大学实验动物中心提供。

2 实验方法

2.1 Cocktail探针药物溶液的制备 取探针药物咖啡因、甲苯磺丁脲、右美沙芬、氯唑沙宗及咪达唑伦适量，精密称定至同一容量瓶中，以0.9%氯化钠注射液定容至刻度，配置成质量浓度分别为0.209、0.104、0.205、0.103、0.109 mg/mL的混合探针药物溶液，溶液于给药前新鲜配制，用于大鼠尾静脉注射。

2.2 药液制备 按处方配比取葛根芩连汤(葛根∶黄芩∶黄连∶甘草为5∶3∶3∶2)各味药材饮片，加8倍量水，葛根先煎20 min［13］，余药共煎30 min，煎煮两次，滤过，合并滤液，浓缩，制成每毫升含1 g生药的药液。葛根组、芩连组(黄芩和黄连)、甘草组样品制备方法同上，最终定容到相同体积。

2.3 标准曲线及质控样品制备 精密配制并稀释咖啡因质量浓度至 11.6、29、58、290、580、1 160、2 320 ng/mL;精密配制甲苯磺丁脲1 020 ng/mL、右美沙芬216ng/mL、氯唑沙宗1 030 ng/mL、咪达唑仑120 ng/mL，分别同上稀释至不同质量浓度。取内标对照品适量，精密称定后用甲醇溶液定容至1 mg/mL溶液，并稀释制得1 μg/mL卡马西平和氯霉素内标液。向空白血浆中加入一定量各待测物的对照品和内标，即得标准曲线样品。

质控样品 (n=5)配制方法参照标准曲线样品制得低、中、高三个质量浓度样品，质量浓度分别为 11.6、290、2 320 ng/mL(咖啡因);5.1、127.5、1 020 ng/mL(甲苯磺丁脲);1.1、27、216 ng/mL (右 美 沙 芬 );5.2、128.8、1 030 ng/mL(氯唑沙宗);0.6、15、120 ng/mL(咪达唑仑)。

2.4 分组及给药 30只雄性SD大鼠随机分为5组，每组6只，分别为全方组、葛根组、芩连组、甘草组、空白对照组。每日早晨空腹灌胃，给予相应组别的汤剂15 mL/kg，空白对照组给予相同体积的生理盐水。连续给药7 d，均于实验前禁食12 h后，尾静脉注射Cocktail混合探针药物溶液，给药量5 mL/kg，注射剂量为咖啡因1.0 mg/kg，甲苯磺丁脲0.5 mg/kg，右美沙芬1.0 mg/kg，氯唑沙宗0.5 mg/kg，咪达唑仑 0.5 mg/kg，给药后0.083 3、0.25、0.5、1、1.5、2、4、8、12、24 h眼眶取血，8 000 r/min离心5 min，分离血浆。

2.5 样品处理 100μL血浆中加入1μg/mL卡马西平和氯霉素内标溶液各10μL，涡旋混合1 min，加入1 mL乙酸乙酯，涡旋3 min，12 000 r/min离心5 min(4℃)，移取上清液，N2吹干，残留物加入流动相100μL振荡重组，12 000 r/min离心5 min(4℃)，取上清液进样。

2.6 LC-MS/MS测定条件

2.6.1 色谱条件 Inertsil ODS-SP色谱柱 (2.1 mm×100 mm，5μm);流动相为水 (含5 mmol/L乙酸铵，A)-乙腈 (含0.1%甲酸，B)梯度洗脱(0～1.5 min，B:55%;1.5 min～2 min，B:55% ～95%;2 min～3 min，B:95%;3 min～3.5 min，B:95% ～55%;3.5 min～5 min，B:55%);体积流量0.3 mL/min;柱温为室温;进样量10μL。

2.6.2 质谱条件 采用正负离子模式检测，多反应监测模式 (MRM)测定。正离子模式内标为卡马西平，负离子模式内标为氯霉素。主要质谱参数为:气帘气 (CUR)流量8 L/min;雾化气(NEB)流量8 L/min;碰撞气 (CAD)流量12 L/min;离子喷雾电压 (IS)2 000 V;离子源温度(TEM)350℃;其它特征参数如下表1。

表1 混合探针药物及内标质谱参数Tab.1 Mass spectrum parameters of the probe drugs and two internal standards

3 方法学考察

3.1 系统专属性试验 取大鼠空白血浆100μL，按照2.5项操作，得到空白血浆色谱图;同样操作得到混合探针药物溶液血浆色谱图和大鼠尾静脉给药后1 h血浆色谱图。结果表明，在测定条件下，样品测定无干扰，方法专属性高。

3.2 线性范围考察 以待测物质量浓度为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值为纵坐标，用加权最小二乘法进行线性回归，计算标准曲线回归方程，结果表明各组分线性关系良好。结果见表2。

表2 线性关系结果Tab.2 Calibration curve，linear range and correlation coefficient

3.3 精密度和准确度试验 取空白血浆100μL，配制低、中、高3个质量浓度的质控 (QC)样品，每一质量浓度进行五个样本分析，连续测定3 d，以随行标准曲线，计算QC样品中各成分的实测质量浓度，根据QC样品的各成分实测质量浓度计算本法的日内和日间精密度、准确度。结果表明，本方法的高、中质量浓度的样品精密度RSD＜15%，准确度RE＜15%;低质量浓度样品RSD＜20%，准确度RE＜20%，符合《化学药物临床药代动力学研究技术指导原则》相关要求。

3.4 基质效应 取低、中、高三个质量浓度的QC样品，每一质量浓度进行五个样本分析。同时，另取空白血浆100μL，除不加标准溶液外，其它按2.5项下的方法操作，所得的残留物加入相应质量浓度的混合标准溶液10μL，内标10μL，涡旋混合，进样分析，获得相应的峰面积。结果表明，本方法低中高3个质量浓度样品的RSD＜15%，样品不受基质干扰。

3.5 提取回收率试验 空白血浆中加入低、中、高3个质量浓度的QC样品，按2.5项下的方法操作，测得血浆中待测成分和内标的峰面积;其与甲醇配制的低、中、高3个质量浓度的QC样品的峰面积相比，即各成分的提取回收率。各成分在血浆样品中的提取回收率分别为咖啡因75.7%～111.1%(RSD为5.7% ～10.1%)、甲苯磺丁脲75.9% ～94.1%(RSD为4.2% ～10.4%)、右美沙芬105.3% ～114.4%(RSD为7.4% ～12.1%)、氯唑沙宗98.8%～109.5% (RSD为8.1%～9.9%)、咪达唑仑 88.6% ～103.8% (RSD为6.5% ～10.3%)。

3.6 稳定性考察试验 取低、中、高3个质量浓度的QC样品，在室温下 (24℃)放置4 h，4℃保存24 h，在－70℃冰箱内保存一个月，反复冻融 (三个冷冻－解冻循环)，按2.5项下的方法处理，再进行测定 (n=5)，结果表明各成分在上述条件下的稳定性符合规定。

4 实验结果

4.1 药时曲线 大鼠静脉注射Cocktail探针药物后所测得的各组分血药浓度－时间数据用DAS软件拟合，房室模型分析结果数据符合单房室模型，血药浓度－时间曲线见图1。

图1 各组分血药浓度药时曲线Fig.1 Plasma concentration-time profiles of different compatibilities

4.2 药代动力学参数 比较组方与空白组探针药物药代动力学参数AUC值可推断其对代谢酶活性的影响。若组方AUC值较空白组减小，说明组方能诱导代谢酶活性，其生物转化率增加，血药浓度降低;反之，若组方AUC值较空白组增大，则组方抑制代谢酶活性。从表3所得结果可以初步推测，葛根芩连汤全方能诱导大鼠 CYP2C6、CYP2D4的活性，抑制 CYP2E1的活性，对CYP1A2、CYP3A1/2无影响。葛根单方能诱导CYP2C6、CYP3A1/2活性，抑制大鼠 CYP2D4及CYP2E1活性，对CYP1A2无影响。芩连能诱导CYP2C6 的 活 性， 抑 制 CYP1A2、CYP2D4、CYP2E1的活性、对CYP3A1/2无影响。甘草能诱导CYP1A2、CYP2C6和 CYP2D4的活性，抑制CYP3A1/2的活性，对CYP2E1无影响。

表3 5种探针药物药代动力学参数 (±s，n=6)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of five probe drugs(±s，n=6)

表3 5种探针药物药代动力学参数 (±s，n=6)Tab.3 Pharmacokinetic parameters of five probe drugs(±s，n=6)

注:与空白组比较，*P＜0.05

底物/亚型酶 分组 t1/2/h AUC0－t/(μg·h·L－1) CL/(L·h－1·kg－1) MRT0－t /h咖啡因/CYP1A2 空白组 0.799±0.063 1 639.099±189．065 0.582±0.069 1.042±0.063*全方组 0.791±0.031 1 654.326±223．726 0.58±0.079 1.11±0.048葛根组 0.825±0.053 1 514.257±244．348 0.582±0.069 1.152±0.092芩连组 0.654±0.096* 2 071.949±228．581* 0.627±0.108 0.959±0.074甘草组 0.797±0.101 793.357±94．732* 1.159±0.189* 0.934±0.069甲苯磺丁脲/CYP2C6 空白组 8.128±0.460 10 315.411±153．207 0.422±0.003 6.082±0.719全方组 6.925±0.817 7 265.902±774．279* 0.057±0.005 7.843±0.709葛根组 6.561±0.499 7 985.303±1 285．381* 0.053±0.003 8.012±0.414*芩连组 4.425±0.452 6 693.134±359．103* 0.070±0.004 7.052±0.374*甘草组 4.590±0.191 5 635.793±163．038* 0.085±0.003 8.054±0.309*右美沙芬/CYP2D4 空白组 1.531±0.245 289.044±14．789 2.136±0.261 1.722±0.126全方组 0.390±0.026 121.341±23．786* 7.444±1.283 1.657±0.065葛根组 1.180±0.121* 337.647±40．135* 2.824±0.324 1.905±0.194*芩连组 0.923±0.172* 333.314±23．531* 2.841±0.229 1.470±0.136*甘草组 0.904±0.156 244.924±29．419* 3.848±0.425 1.609±0.061氯唑沙宗/CYP2E1 空白组 0.383±0.031 588.457±40．033 0.620±0.060 0.843±0.081全方组 0.325±0.022 700.591±111．469* 0.666±0.107 0.812±0.099葛根组 0.308±0.017* 738.575±102．343* 0.722±0.097 0.789±0.054芩连组 0.404±0.038 730.200±63．779* 0.619±0.099 0.829±0.116甘草组 0.345±0.048 614.598±80．612 0.713±0.125 0.973±0.053*咪达唑仑/CYP3A1/2 空白组 0.506±0.040 70.227±12．849 6.569±1.133 0.839±0.058全方组 0.374±0.055 70.246±9．063 6.440±0.838 0.849±0.070葛根组 0.443±0.046 47.875±4．387* 8.654±0.598 0.956±0.106*芩连组 0.453±0.013 75.500±14．774 5.506±0.323 0.776±0.071甘草组 0.256±0.029* 83.504±14．203* 8.551±1.208* 0.472±0.037*

5 讨论

目前检测肝药物代谢酶主要有体内和体外两种方法。体外代谢法包括体外肝微粒体温孵法、肝灌流法及肝组织切片法等。它是在体外模拟生理环境下进行代谢反应并对原形药及代谢产物进行分析的方法，该方法较为简单，但有时不能全面反映体内的综合代谢情况，与生物体内的真实代谢情况存在一定差异［14］。体内代谢法是指服药后经过一段时间收集生物样品，然后分析样品中药物及药物代谢产物的方法。Cocktail探针药物法是体内代谢的主要方法，其实验结果更符合真实代谢情况;可以同时检测多种药物代谢酶的活性;降低个体间和个体内药物代谢酶活性变异的影响。课题组前期采用体外肝微粒体温孵法，初步研究了葛根芩连汤全方及其不同配伍组对体外肝微粒体亚型酶活性的影响，结果提示不同配伍组对CYP450酶具有一定的诱导或抑制效应。

本实验在前期工作基础上采用体内Cocktail探针药物法，深入研究葛根芩连汤全方及方中葛根组、芩连组及甘草组对5种CYP450亚型酶活性的影响。采用LC-MS/MS法检测不同时间点的全血中各探针药物的浓度，用DAS2.0软件计算其药代动力学参数，用统计软件SPSS19.0分析空白组与实验组各种探针AUC值的差别，评价各组药物对CYP450亚型酶诱导或抑制的影响，方法较为可靠。

研究结果表明葛根芩连汤全方、葛根组、芩连组均对CYP2E1产生显著的抑制作用，且葛根组的抑制作用较强，推测全方对CYP2E1的抑制作用主要来自君药葛根。该方可减缓该亚型酶对药物的代谢速率，一定程度上有助于体内吸收。大鼠CYP2E1和人CYP2E1有很好的相关性［15］，此结果可为临床用药提供参考。全方对CYP1A2无显著影响，推测可能由于甘草组诱导CYP1A2的活性而芩连组抑制其活性所致;同样，全方对CYP3A1/2无显著影响可能是葛根组的诱导作用和甘草组的抑制作用所致。

复方配伍中不同中药构成了复杂的相互作用体系，这些相互作用是复方整体效应的重要基础，药物代谢酶是影响药物体内相互作用的主要因素。通过文献［16-19］可知CYP450代谢酶不仅在药物的代谢、降解和排泄中起着重要作用，并且对复方配伍研究具有重要意义。本研究从“药物配伍-代谢”关系探讨复方配伍机制，为深入认识葛根芩连汤配伍机制提供事实依据，有利于更科学、更合理地指导临床用药。

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