克咳片药效学研究

钟志勇， 郑佳琳， 钟海潮， 严家荣， 孙 侠， 徐吉银， 成金乐*

(1.广东省医学实验动物中心，广东佛山528248;2.中山市中智药业集团有限公司，广东中山528437)

克咳片是由麻黄、罂粟壳、甘草、苦杏仁、桔梗、莱菔子、石膏等提取而成的片剂，具有止咳、平喘、祛痰的功效，临床适用于各种急慢性咳嗽、风寒咳嗽、风寒夹痰湿咳嗽或郁热等适应症。本实验对克咳片进行抗炎、止咳、平喘的药效学研究。

1 材料与方法

1.1 实验动物 SPF级NIH小鼠50只 (雄性);SPF级KM小鼠65只 (雄性32只;雌性33只);SPF级SD大鼠110只 (雄性)，Hartley豚鼠66只(雄性30只;雌性36只)，由广东省医学实验动物中心提供，合格证号:0066978、0066980、0069741、0066979、0068872，饲养于广东省医学实验动物中心SPF级动物实验室，5只/箱，群养，温度为20～25℃，相对湿度40% ～70%，采用12 h∶12 h昼夜间断照明，自由进食和饮水，饲料和饮用水均由本中心提供，环境设施使用许可证:SYXK(粤)2008-0002。

1.2 药物 克咳片，中山市中智药业集团有限公司 提 供，批 号 20100512，规 格 0.54 g/片，2片/次，2次/日;常温干燥保存;使用前将克咳片研成粉末，加0.5%羧甲基纤维素钠配制成所需的浓度。通宣理肺片，广东省博罗先锋药业集团有限公司提供，批号005002，规格0.3 g/片，4片/次，2～3次/日。氨茶碱片，100 mg/片，汕头金石制药总厂生产，批号101104。

1.3 主要试剂 二甲苯，广州市中南化学试剂有限公司提供，批号100501;角叉菜胶，晶欣生物科技公司提供，批号20100426。氯化乙酰胆碱:Alfa Aesar生产，批号10132497;磷酸组织胺，美国BIOEER分装，批号20091022。25%氨水，广州化学试剂二厂，批号2008040801。卵白蛋白:CALBIOCHEM公司生产，批号D00094870;细胞间黏附因子 (ICAM-1)、血管细胞黏附因子(VCAM-1)、L-选择素ELISA试剂盒，均由武汉华美生物工程有限公司提供，批号分别为 CSBE04576r、CSB-E07275r、 CSB-E07431r。 鼠 抗 NF-kB p65单抗，北京中杉金桥生物技术有限公司，批号201006。

1.4 主要仪器 PV—200足趾容积测量仪，精密度:0.01 mL，成都泰盟科技有限公司;UV—1200紫外可见分光光度计，广州市正一科技公司产品。WH—8002超声雾化器，汕头市光电医疗器械厂;臭氧发生器:购自广州臭氧科技有限公司。臭氧检测仪:北京康尔兴科技发展有限公司，型号05525;RM2135轮转切片机，德国LEICA公司;日本奥林巴斯BX41显微镜，HMIAS—2000医学图文分析系统，武汉千屏影像技术有限责任公司。

2 实验方法

2.1 克咳片对二甲苯所致小鼠耳肿胀的影响［1］SPF级NIH小鼠，雄性，50只。随机分为模型对照组、通宣理肺片组、克咳片低、中、高剂量组，10只/组。各组小鼠按照20 mL/kg体质量灌胃给药，1次/d，连续2 d。末次给药0.5 h后，在小鼠右耳涂布二甲苯0.05 mL/只，左耳给予蒸馏水。2 h后处死小鼠，剪下左右耳片，用直径9 mm的打孔器分别在左、右耳同一部位打下圆耳片，测量两耳片质量差为肿胀度。

2.2 克咳片对角叉菜胶致大鼠足肿胀的影响［2］SPF级SD大鼠，雄性，50只。随机分为模型对照组、通宣理肺片组、克咳片低、中、高剂量组，10只/组。各组大鼠按照10 mL/kg体质量灌胃给药，1次/d，连续2 d。末次给药1 h后，于大鼠右后足跖皮下注射1%角叉菜胶0.1 mL/只。每隔1 h测量足跖体积，连续6 h，分别按下式计算肿胀度和抑制率 (%)。

2.3 克咳片对氯化乙酰胆碱和组织胺致豚鼠哮喘模型的影响［3］将豚鼠放入喷雾装置箱内，超声波雾化器恒压喷入2%氯化乙酰胆碱和0.1%组织胺混合液气雾15 s。选择150 s内出现哮喘反应的60只豚鼠进行试验。根据豚鼠引喘潜伏期随机分为模型对照组、通宣理肺片组、氨茶碱片组、克咳片低、中、高剂量组，10只/组，雌雄各半。各组动物按照10 mL/kg体质量灌胃给药，1 h后将豚鼠放入喷雾装置箱内，每次1只。按筛选时同样条件恒压喷雾2%氯化乙酰胆碱和0.1%组织胺混合液15 s。记录喷雾开始至症状出现的时间 (以抽搐、跌倒为准)，作为给药1 h后的潜伏时间。第2天，各组动物继续灌胃给药，连续6 d，末次给药1 h后，记录致喘的潜伏时间。

2.4 克咳片对氨水引咳小鼠模型的影响［4］将65只KM小鼠放入多功能诱咳引喘仪箱内，诱咳药物为25%氨水，给药时间设置为8 s，计数时间设置为3 min，记录小鼠咳嗽潜伏期及次数。根据咳嗽次数按将KM小鼠随机分为模型对照组、通宣理肺片组、克咳片低、中、高剂量组，10只/组，雌雄各半。各组均按20 mL/kg体质量灌胃给药，连续5 d，末次给药1 h后，将小鼠放入多功能诱咳引喘仪箱内，按预选时同样条件诱咳，记录咳嗽潜伏期及3 min内动物出现的咳嗽次数。

2.5 克咳片对气道高反应模型大鼠的影响 造模方法参考文献［5-6］。将60只大鼠随机分为正常对照组10只和模型组50只。模型组大鼠于实验第0天腹腔注射0.6% 卵白蛋白-氢氧化铝致敏液1 mL/只;于实验第7、第14天腹腔注射0.2% 卵白蛋白-氢氧化铝致敏液1 mL/只;正常对照组大鼠给予等量的生理盐水。于实验第15天，模型组大鼠每天吸入2.0 mL/L臭氧1 h，连续7 d。于实验第21天，模型组大鼠随机分为模型对照组、通宣理肺片组，克咳片低、中、高剂量组，10只/组。除正常对照组外，各组大鼠分别按照10 mL/kg体质量灌胃给药，给药30 min后将大鼠置于雾化吸入箱中以1% 卵白蛋白溶液激发30 min，连续7 d。末次给药1 h，大鼠麻醉后放血处死，结扎左肺，用5 mL冷5%NaHCO3灌洗右侧肺叶，重复3次，回收支气管肺泡灌洗液。于4℃，1 500 r/min，离心10 min，收集上清液。ELISA检测支气管肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1、L-选择素测定，病理组织学检查左肺组织和免疫组化检测肺组织NF-κB p65的表达。

2.6 统计学方法 所有数据采用SPSS 16.0软件进行统计分析。将原始数据以均数加减标准差表示(±s)，单因素方差分析。病理学检查采用秩和检验分析各组各项的组间差异。

3 结果

3.1 克咳片对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响见表1。

表1 克咳片对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 (±s)Tab.1 Effect of Keke Tablets on mice ear swelling caused by dimethylbenzene(±s)

表1 克咳片对二甲苯所致小鼠耳廓肿胀的影响 (±s)Tab.1 Effect of Keke Tablets on mice ear swelling caused by dimethylbenzene(±s)

注:与模型对照组比较，*P＜0.05

组 别 剂量/(g·kg－1·d－1)动物数/只肿胀度/mg模型对照组 －10 28.8±7.0通宣理肺片组 0.3 10 22.7±5.9*克咳片低剂量组 0.09 10 28.9±5.7克咳片中剂量组 0.18 10 26.5±8.2克咳片高剂量组 0.36 10 20.6±9.4*

克咳片高剂量组、通宣理肺片组小鼠的耳廓肿胀度与模型对照组比较显著性降低 (P＜0.05)，其余各给药组小鼠的耳廓肿胀度与模型对照组比较均无显著性差异 (P＞0.05)。结果提示克咳片可能具有减轻小鼠耳廓肿胀的作用。

3.2 克咳片对角叉菜胶所致大鼠足趾肿胀的影响见表2。

表2 克咳片对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀度的影响 (n=10，±s)Tab.2 Effect of Keke Tablets on rat paw swelling induced by carrageenine(n=10，±s)

表2 克咳片对角叉菜胶诱导的大鼠足肿胀度的影响 (n=10，±s)Tab.2 Effect of Keke Tablets on rat paw swelling induced by carrageenine(n=10，±s)

注:与模型对照组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01

组 别肿胀度/mL 1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h模型对照组 0.39±0.10 0.48±0.10 0.59±0.09 0.38±0.11 0.37±0.13 0.30±0.13通宣理肺片组 0.27±0.13* 0.35±0.13* 0.45±0.19 0.34±0.17 0.30±0.16 0.24±0.13克咳片低剂量组 0.27±0.16 0.41±0.16 0.48±0.15 0.36±0.15 0.31±0.16 0.26±0.15克咳片中剂量组 0.26±0.12* 0.35±0.12* 0.51±0.11 0.42±0.12 0.33±0.11 0.25±0.09克咳片高剂量组 0.19±0.08＊＊ 0.33±0.10＊＊ 0.43±0.10＊＊ 0.32±0.10 0.23±0.09* 0.18±0.08*

与模型对照组对比，克咳片高剂量组大鼠的足肿胀度在 1、2、3、5、6 h显著性降低 (P＜0.05)，肿胀抑制率分别为 50.1%、30.7%、27.1%、15.1%、36.8%和39.2%;克咳片中剂量组和通宣理肺片组大鼠的足肿胀度在造模后1 h、2 h显著性降低 (P＜0.05)，其肿胀抑制率分别为32.8%、26.7%和29.1%、26.1%;3～6 h均无统计学差异 (P＞0.05);克咳片低剂量组大鼠的足肿胀度在造模后1～6 h均无统计学差异 (P＞0.05)。结果提示克咳片可能具有抑制角叉菜胶致大鼠足趾肿胀的作用。

3.3 克咳片对氯化乙酰胆碱和组织胺致豚鼠哮喘模型的影响 见表3。

表3 克咳片对氯化乙酰胆碱和组织胺致豚鼠哮喘的影响 (±s)Tab.3 Effect of Keke Tablets on the asthma in guinea pig induced by acetylcholine and histam ine(±s)

表3 克咳片对氯化乙酰胆碱和组织胺致豚鼠哮喘的影响 (±s)Tab.3 Effect of Keke Tablets on the asthma in guinea pig induced by acetylcholine and histam ine(±s)

注:与模型对照组比较，*P＜0.05。因造模过度，通宣理肺片组死亡1只大鼠，克咳片低剂量组死亡2只大鼠

组 别 动物数/只 剂量/(g·kg－1·d－1)哮喘潜伏期/s给药前 给药1 h 给药6 d后模型对照组10 － 55.9±6.4 68.7±6.9 72.2±11.1通宣理肺片组 9 0.6 55.9±6.0 76.7±20.6 77.9±20.5氨茶碱片组 10 0.1 59.4±7.1 81.8±25.4 104.6±23.7*克咳片低剂量组 8 0.18 57.3±7.0 77.4±12.1 94.6±27.1*克咳片中剂量组 10 0.36 57.3±8.0 70.1±11.7 87.5±21.2克咳片高剂量组 10 0.72 57.3±6.4 85.1±30.7 100.0±37.5*

给药1 h，通宣理肺片组、克咳片各剂量组豚鼠的哮喘潜伏期与模型对照组比较，均无统计学差异 (P＞0.05)。给药6 d后，克咳片低、高剂量组、氨茶碱片组豚鼠的哮喘潜伏期与模型对照组比较显著性延长，具有统计学差异 (P＜0.05)，其余各组豚鼠的哮喘潜伏期与模型对照组比较均无统计学差异 (P＞0.05)。

4.4 克咳片对氨水引咳小鼠模型的影响 见表4。

表4 克咳片对氨水引咳模型小鼠的影响 (±s)Tab.4 Effect of Keke Tablets on the cough in mice induced by ammonia water(±s)

表4 克咳片对氨水引咳模型小鼠的影响 (±s)Tab.4 Effect of Keke Tablets on the cough in mice induced by ammonia water(±s)

注:与模型对照组比较，*P＜0.05

组 别 动物数/只 剂量/(g·kg－1·d －1)咳嗽潜伏期/s 3 min内咳嗽次数/次给药前 给药后 给药前 给药后模型对照组10 － 62.7±28.1 78.4±26.3 55.4±18.0 37.2±15.4通宣理肺片组 10 0.6 68.8±28.8 112.8±37.8* 55.8±19.4 25.1±18.0克咳片低剂量组 10 0.18 70.1±29.6 104.5±27.3* 54.9±16.4 29.8±14.3克咳片中剂量组 10 0.36 78.1±37.1 105.5±16.5* 53.5±17.2 23.1±14.6*克咳片高剂量组 10 0.72 78.0±29.0 105.2±25.7* 54.9±19.3 22.0±13.2*

通宣理肺片组、克咳片各剂量组小鼠的咳嗽潜伏期与正常对照组比较，显著性延长 (P＜0.05)。克咳片中、高剂量组小鼠的3 min内咳嗽次数与正常对照组比较显著性减少 (P＜0.05)，其余各组小鼠3 min内咳嗽次数与正常对照组比较无显著性差异 (P＞0.05)。

3.5 克咳片对气道高反应大鼠模型的影响

3.5.1 克咳片对气道高反应大鼠的一般临床症状观察 造模期间，1% 卵白蛋白雾化致敏期间，除了正常对照组外，其余各组大鼠均出现不同程度头面部搔痒、呼吸加快、鼻子有少量血性分泌物，其中模型对照组较为严重。

3.5.2 肺泡灌洗液ICAM-1、VCAM-1、L-选择素测定 见表5。

表5 克咳片对气道高反应大鼠支气管肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1、L-选择素的影响 (±s)Tab.5 Effect of Keke Tablets on ICAM-1，VCAM-1 and L-selection in bronchoalveolar lavage fluid of airway hyperresponsiveness rat(±s)

表5 克咳片对气道高反应大鼠支气管肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1、L-选择素的影响 (±s)Tab.5 Effect of Keke Tablets on ICAM-1，VCAM-1 and L-selection in bronchoalveolar lavage fluid of airway hyperresponsiveness rat(±s)

注:与正常对照组比较，△P＜0.05;与模型对照组比较，*P＜0.05

组 别 动物数/只 剂量/(g·kg－1·d－1) ICAM-1/(ng·mL－1)VCAM-1/(ng·mL－1) L-选择素/(ng·mL－1)正常对照组10 － 10.14±0.81 19.53±0.42 0.52±0.02模型对照组 10 － 21.10±2.99△ 20.97±0.39△ 0.51±0.03通宣理肺片组 10 0.6 18.30±3.82 18.80±0.50* 0.52±0.02克咳片低剂量组 10 0.18 13.10±1.75* 19.67±0.55* 0.48±0.02克咳片中剂量组 10 0.36 13.07±2.20* 19.45±0.66* 0.53±0.03克咳片高剂量组 10 0.72 12.18±1.30* 18.90±0.50*0.48±0.02

实验结果显示，与正常对照组相比，模型对照组大鼠支气管肺泡灌洗液中L-选择素水平均无统计学差异 (P＞0.05)，ICAM-1、VCAM-1水平均增加 (P＜0.05);与模型对照组相比，通宣理肺片组大鼠支气管肺泡灌洗液中VCAM-1水平减少(P＜0.05)，ICAM-1和L-选择素水平均无统计学差异 (P＞0.05);与模型对照组相比，克咳片各剂量组大鼠支气管肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1水平均减少 (P＜0.05)，L-选择素水平均无统计学差异 (P＞0.05)。

3.5.3 克咳片对气道高反应大鼠肺组织 NF-κB p65表达的影响［7］实验结果显示，与正常对照组相比，模型对照组NF-κB p65平均光密度值显著升高 (P＜0.01);克咳片各组大鼠的NF-κB p65平均光密度值与模型对照组相比均未见统计学显著差异 (P＞0.05)，但呈现出减少的趋势。见图1，表6。

表6 克咳片对气道高反应大鼠肺组织NF-κB p65表达的影响(±s)Tab.6 Effect of Keke Tablets on the level of NF-κB p65 in lung tissue of airway hyperresponsiveness rat(±s)

表6 克咳片对气道高反应大鼠肺组织NF-κB p65表达的影响(±s)Tab.6 Effect of Keke Tablets on the level of NF-κB p65 in lung tissue of airway hyperresponsiveness rat(±s)

注:与正常对照组比较，△△P＜0.01

组 别 剂量/(g·kg－1·d－1)动物数/只 平均光密度值正常对照组 －10 0.115±0.022模型对照组 － 10 0.155±0.007△△通宣理肺片组 0.6 10 0.139±0.025低剂量组 0.18 10 0.149±0.007中剂量组 0.36 10 0.153±0.006高剂量组0.72 10 0.140±0.011

图1 克咳片对气道高反应大鼠肺组织中NF-κB p65表达图 (DAB染色，×400)Fig.1 Effect of Keke Tablets on the level of NF-κB p65 in lung tissue of airway hyperresponsiveness rat determ ined by immunohistochem istry

3.5.4 克咳片对气道高反应大鼠肺组织病理变化的影响［8］与正常对照组相比，模型对照组大鼠支气管黏膜上皮部分脱落，部分支气管管壁平滑肌增厚、断裂，细、小支气管黏膜增厚，皱襞增多、延长，纤毛不整，部分纤毛脱落，杯状细胞局灶显著增多，细小支气管周嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润明显，肺泡间隔不同程度增厚、间隔中淋巴细胞增多，小血管扩张充血。与模型对照组相比，通宣理肺片组、克咳片低、中、高剂量组大鼠的细小支气管周嗜酸性粒细胞浸润程度均有明显下降 (P＜0.05)，但肺组织支气管黏膜病变、管壁病变、肺泡间隔病变及淋巴细胞浸润情况未见明显改善作用(P＞0.05)。见图2，表7。

表7 克咳片对气道高反应大鼠的肺组织病理检查结果Tab.7 Effect of Keke Tablets on histopathologic changes of lung tissue in airway hyperresponsiveness rat

图2 克咳片对气道高反应大鼠肺组织病理改变的影响 (HE染色，×100)Fig.2 Effect of Keke Tablets on histopathologic changes of lung tissue in airway hyperresponsiveness rat

4 讨论

从中医辨证的角度来看，痰、咳、喘三者关系密切，互为因果，在治疗时化痰药与止咳平喘药常配伍应用［9］。克咳片源自张仲景的《伤寒杂病论》里治疗肺热喘咳的名方“麻杏甘石汤”，后人依据“以材相制，气味相洽”的原则，改其初衷，存其成性，加入了桔梗、罂粟壳、莱菔子三味药材，使其止咳、平喘、化痰的疗效更显著，并拓宽了主治范围。动物实验结果显示，克咳片具有抑制二甲苯致小鼠耳廓肿胀和角叉菜胶致大鼠足趾肿胀作用，延长氯化乙酰胆碱和组胺诱发豚鼠哮喘的潜伏期。延长氨水诱发小鼠咳嗽的潜伏期，降低3 min中内小鼠咳嗽次数，减轻卵白蛋白雾化致敏时大鼠的哮喘症状，结果表明克咳片具有明显的抗炎、止咳、平喘、祛痰的作用。

本实验对克咳片祛痰平喘的作用机制作了更为深入的研究。支气管哮喘实质是以嗜酸性粒细胞为主的多种炎症细胞及其释放的细胞因子及炎症介质导致的呼吸道慢性炎症性疾病［10］。研究表明，ICAM-1和VCAM-1与嗜酸性粒细胞在变态反应炎症部位的移行和募集有关，在支气管哮喘患者中，可检测到患者血清ICAM-1和VCAM-1水平均明显增高［11］。L-选择素可以介导T淋巴细胞向炎症部位迁徙，加重后续的气道高反应性发展［12］，但L-选择素的升高往往反映哮喘处于缓解期［13］。NF-κB是免疫和炎症反应的重要调控因子，可被细胞因子、黏附因子等介质激活，加速炎症发生发展［14］。在实验中，观察到气道高反应大鼠模型对照组大鼠支气管肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1水平均显著增加，肺组织NF-κB p65平均光密度值显著升高，支气管周嗜酸性粒细胞、淋巴细胞浸润明显，杯状细胞增多，肺泡间隔不同程度增厚、间隔中淋巴细胞增多，小血管扩张充血等病理特征。克咳片各剂量组大鼠支气管肺泡灌洗液中ICAM-1、VCAM-1水平均减少，克咳片各剂量组大鼠的细小支气管周嗜酸性粒细胞浸润程度均有明显下降，提示克咳片对气道高反应疾病具有一定的治疗作用，其作用机制可能与减少肺部组织中 ICAM-1、VCAM-1水平有关。

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