藠头总甾体皂苷对高脂大鼠降脂作用研究

雷荣剑， 李 军， 金圣煊， 徐淑媛， 晏桂敏， 何俏军

(1.浙江大学药学院，浙江杭州310058;2.杭州创新中药标准化研究所有限公司，浙江杭州310053)

高脂血症是动脉粥样硬化及相关疾病如冠心病、缺血性脑血管疾病和外周血管疾病的主要诱因。患者在临床上表现的特征为血清中总胆固醇(TC)、总甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白 (LDLC)的升高及高密度脂蛋白 (HDL－C)的降低［1］。目前临床用于调节高血脂症的药物主要为他汀类，能显著降低血清中 (LDL－C)等水平，其使用能大大降低心血管疾病发生的风险，然而，而单靠服用他汀类药物并不能完全满足临床上所有患者对调节高血脂症的需要，因为他汀类药物的靶点比较单一，且他汀类药物的过多服用也存在如皮疹等副作用［2］。藠头Allium chinense G.Don，又名薤，记载于《神农本草经》，是百合科葱属植物，它的干燥鳞茎作为薤白的药用来源之一，被2010年版《中国药典》收载［3］。藠头除了作为药食两用作物在中国广泛使用外，在世界上其他国家也广泛应用于香料调味品和蔬菜［4］。藠头既可食用又能入药，具有多种药理作用和保健功能，其中就包括对心血管疾病如高血脂、高血压、高血糖症的调节及在血小板聚集、血纤维蛋白溶解过程的调节作用［5］。研究表明甾体皂苷如薯蓣皂苷、番麻皂素、菝契皂苷及异菝葜皂苷类物质是百合科植物的主要活性成分，大多具有增加冠脉流量、营养心肌、改善外周循环、抑制血小板聚集及降低血清总胆固醇和甘油三酯等药理作用［6－7］。目前仅有研究发现从藠头中提取分离的甾体皂苷成分对环腺苷酸磷酸二酯酶和Na+－K+－ATP 酶有抑制作用［8］，而对该成分在高脂血症上起的调节作用未有报道，本文研究工作便以此为切入点，通过高脂饲料喂养诱发高脂大鼠模型，考察藠头总甾体皂苷给药后对其血脂水平、抗氧化能力、脂蛋白代谢酶和肝脏细胞形态的影响，从血清学、病理学等角度阐明藠头总甾体皂苷对高脂血症的调节机制。

1 材料和方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物 雄性SD大鼠，体质量约180 g，由浙江省医学科学院实验动物中心提供。

1.1.2 仪器与试药 Agilent 1100系列高效液相色谱仪，DAD检测器，甲醇、乙腈均为色谱纯，乙醇为分析纯，水为自制重蒸水。菝葜皂苷元(中检所，1539200001)。美国伯乐680酶标仪。藠头鲜品，采自浙江新昌，经浙江省医学科学院助理研究员余陈欢鉴定为Allium chinense G.Don的干燥鳞茎;猪油自制，胆固醇 (国产)，胆盐，蛋黄;脂蛋白脂酶 (LPL)，肝酯酶 (HL)，谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH－Px)，超氧化物歧化酶 (SOD)，丙二醛 (MDA)试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

1.2.1 藠头总甾体皂苷的制备 取500 g新鲜的藠头，加10倍量 (质量比)的80%乙醇回流提取两次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇并浓缩至约200 mL(乙醇质量分数在10%以下)。浓缩液加蒸馏水300 mL稀释后静置过夜，取下层沉淀加150 mL水稀释，加等量 (体积比)水饱和正丁醇萃取3次，合并萃取液，减压回收正丁醇并浓缩至干，残留物加95%乙醇搅拌至溶解完全后，加丙酮至无沉淀产生，抽滤，取滤液浓缩后减压干燥，得3 g左右白色干燥物，保存于4℃冰箱［9］。参考Miao等发表的文献方法［10］，取少量干燥物进行Liebermann－Burchard显色反应试验，结果呈阳性，提示总甾体皂苷可能是白色干燥物主要成分。

1.2.2 HPLC分析 为了测定藠头总甾体皂苷中甾体皂苷元的量，试验采用反相高效液相色谱法:ZORBAX Extent－C18色谱 柱 (4.6mm × 250mm，5 μm)，柱温30℃，以乙腈－水为流动相，乙腈为38%，体积流量1 mL/min，检测波长204 nm，进样量10μL。在HPLC测定前，将0.2 g总甾体皂苷溶解于20 mL 2 mol/L稀盐酸并加热回流2 h，冷却后加40%氢氧化钠至pH中性溶液，溶液用三氯甲烷萃取3次，每次25 mL，合并萃取液减压回收三氯甲烷至干，残渣加甲醇溶解并定容至25 mL量瓶，过0.45μm滤膜，供HPLC测定［11］。

1.2.3 动物实验方法 取雄性SD大鼠48只，随机分成6组，每组8只，即空白对照组、高血脂模型组、藠头总甾体皂苷低剂量组 (50 mg/kg)，藠头总甾体皂苷中剂量组(100 mg/kg)，藠头总甾体皂苷高剂量组(200 mg/kg)，阳性药洛伐他汀对照组 (2.5 mg/kg)。给予正常饲料1周后，除空白对照组给予正常饲料外，其他各组均用高脂饲料［12］(78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油、0.2%胆盐)喂养，动物自由饮水。在给予高脂饲料4周后，空白对照组和模型组大鼠给予同量水，总甾体皂苷各给药组及洛伐他汀对照组连续灌胃4周，每周称量体质量1次。

1.2.4 血清测定及肝脏形态学观察 在末次给药后24 h，于10%水合氯醛麻醉 (35 mg/kg，腹腔注射)下，自大鼠腹主动脉取血，于3 000 r/min离心10 min后取血清，测定血清中总胆固醇 (TC)、总甘油三酯 (TG)、低密度脂蛋白 (LDL－C)、丙二醛 (MDA)、高密度脂蛋白 (HDL－C)、谷胱甘肽过氧化酶 (GSH－Px)和超氧化物歧化酶 (SOD)的水平。大鼠肝脏取出后，称取200 mg肝组织加10%生理盐水匀浆，3 000 r/min离心10 min，取上清液测脂蛋白酯酶 (LPL)和肝脂酶 (HL)的水平。在肝脏最大叶距边缘0.5 cm处取肝组织 (约0.5 cm×0.5 cm×0.5 cm)用0.9%氯化钠溶液冲洗，浸泡于10%福尔马林溶液过夜，经脱水、石蜡包埋及切片后得到约4μm的切片，用苏木精染色后至光镜观察［13］。

2 结果

2.1 HPLC分析 因文献报道菝葜皂苷元 (sarsasapogenin)为藠头甾体皂苷的主要水解产物［14－15］，试验拟采用菝葜皂苷元为对照品定量测定藠头总甾体皂苷。色谱图见图1，样品中菝葜皂苷元分离度良好 (18.988 min)，藠头总甾体皂苷中菝葜皂苷元纯度为8.2%。以菝葜皂苷元为对照品，经香草醛－冰醋酸－高氯酸紫外显色法测定藠头总甾体皂苷纯度为65.7%［16］。

图1 总甾体皂苷高效液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram s of total steroidal saponins

2.2 藠头总甾体皂苷对大鼠血清TC、TG、LDL－C及HDL－C水平的影响 如表1所示，经给药4周后，与空白对照组比较，喂饲高脂饲料的模型组大鼠血清 TC、TG、LDL－C水平明显增高 (P＜0.05)，分别增加115%、147%、93%，而HDL－C水平下降23%(P＜0.05)，提示高脂饲料喂养后的大鼠符合用于筛选治疗药物要求。与模型组比较，藠头总甾体皂苷给药组和洛伐他汀组对高脂饲料诱导的高血脂大鼠的TC、TG、LDL－C水平、动脉硬化指数AI［AI=(总胆固醇－高密度脂蛋白)÷高密度脂蛋白］均有降低作用，其中藠头总甾体皂苷中剂量组和高剂量组给药后不仅分别降低TC为33%和44%、TG为24%和42%、LDL－C为32%和38%(P＜0.05)，而且分别升高HDL－C为18%和24%(P＜0.05)。表明中、高剂量的藠头总甾体皂苷给药对高脂饲料喂养诱发的大鼠高脂血症具有较好的调节作用。

表1 藠头总甾体皂苷对大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响 (±s，n=8)Tab.1 Effects of total steroidal saponins on serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in rats(±s，n=8)

表1 藠头总甾体皂苷对大鼠血清TC、TG、LDL-C、HDL-C的影响 (±s，n=8)Tab.1 Effects of total steroidal saponins on serum levels of TC，TG，LDL-C and HDL-C in rats(±s，n=8)

注:与高血脂模型组相比较，*P＜0.05

组 别TC/(mmol·L －1)TG/(mmol·L －1)HDL－C/(mmol·L －1)LDL－C/(mmol·L －1)动脉硬化指数空白对照组 1.11±0.31* 0.86±0.08* 1.02±0.22* 0.67±0.11*0.09±0.02高血脂模型组 2.39±0.41 2.12±0.49 0.79±0.13 1.30±0.21 2.01±0.28阳性对照组 1.15±0.25* 1.23±0.13* 0.95±0.12* 0.73±0.27* 0.20±0.03*藠头总甾体皂苷低剂量组 1.88±0.38 1.72±0.25 0.87±0.11 0.95±0.18* 1.16±0.31*藠头总甾体皂苷中剂量组 1.60±0.20* 1.62±0.37* 0.93±0.15* 0.89±0.21* 0.72±0.22*藠头总甾体皂苷高剂量组 1.33±0.24* 1.24±0.28* 0.98±0.21* 0.80±0.15* 0.37±0.09*

2.3 藠头总甾体皂苷对大鼠肝脏HL和LPL水平的影响 HL和LPL在血清甘油三酸酯类物质清除中扮演重要角色，其中LPL作为脂肪分解酶能将甘油三酯、乳糜微粒中的磷脂、中密度脂蛋白等水解［17］。而HL作为肝细胞合成的脂肪分解酶对脂蛋白代谢也具有多方面影响，其活性与LDL和HDL颗粒存在的大小和密度相关［18－19］。如表2所示，空白组和模型组间的HL和LPL水平没有显著性差异。相比空白组，洛伐他汀组的LPL值略微升高，而HL值却有所减少，与文献报道一致［20］。藠头总甾体皂苷给药组的HL和LPL值显著升高，其中藠头总甾体皂苷高剂量组相对于空白、模型及洛伐他汀组，分别升高HL值 (39%，30%，53%)(P＜0.05)，升高 LPL值 (49%，28%，60%)(P＜0.05)。表明藠头总甾体皂苷高剂量组给药能提高高脂大鼠肝脏HL和LPL水平。

表2 藠头总甾体皂苷对大鼠肝脏HL和LPL水平的影响(±s，n=8)Tab.2 Effects of total steroidal saponins on hepatic levelsof HL and LPL in rats(±s，n=8)

表2 藠头总甾体皂苷对大鼠肝脏HL和LPL水平的影响(±s，n=8)Tab.2 Effects of total steroidal saponins on hepatic levelsof HL and LPL in rats(±s，n=8)

注:与高血脂模型组相比较，*P＜0.05

组 别HL/(U·mg prot－1)LPL/(U·mg prot－1)空白对照组1.23±0.19 0.93±0.17高血脂模型组 1.31±0.23 1.09±0.19阳性对照组 1.12±0.22 1.07±0.13藠头总甾体皂苷低剂量组 1.44±0.25 1.17±0.19藠头总甾体皂苷中剂量组 1.57±0.28 1.28±0.26*藠头总甾体皂苷高剂量组 1.71±0.31* 1.39±0.27*

2.4 藠头总甾体皂苷对大鼠血清GSH－Px、MDA、SOD水平的影响 研究表明血液中存在的SOD/GSH－Px等抗氧化酶有助于清除体内氧自由基和阻止脂质过氧化发生，而MDA是脂质过氧化的重要终末产物之一，其水平的多少预示脂质过氧化的速率和强度［21］。本实验通过对血清 GSH－Px、MDA、SOD的测定，以进一步明确藠头总甾体皂苷调节血脂的作用机制。如表3所示，与空白组相比，模型组的GSH－Px和SOD水平显著降低。与模型组相比，藠头总甾体皂苷给药组的GSH－Px和SOD水平显著升高，且呈剂量依赖性趋势，其中藠头总甾体皂苷高剂量组升高了GSH－Px和SOD水平分别为25%、23%(P＜0.05)。另一方面，模型组MDA水平显著上升 (P＜0.05)，而相比模型组，藠头总甾体皂苷和洛伐他汀组的MDA水平都呈下降趋势，特别是中、高剂量的藠头总甾体皂苷给药显著降低MDA水平 (P＜0.05)。以上结果表明藠头总甾体皂苷给药能提升大鼠体内抗氧化酶水平及降低血清MDA水平。

表3 藠头总甾体皂苷对大鼠血清GSH-Px、MDA、SOD水平的影响 (±s，n=8)Tab.3 Effects of total steroidal saponins on serum levels of GSH-Px，MDA and SOD in rats(±s，n=8)

表3 藠头总甾体皂苷对大鼠血清GSH-Px、MDA、SOD水平的影响 (±s，n=8)Tab.3 Effects of total steroidal saponins on serum levels of GSH-Px，MDA and SOD in rats(±s，n=8)

注:与高血脂模型组比较，*P＜0.05

组 别GSH－Px/(U·mL－1)SOD/(U·mL－1)MDA/(nmol·mL －1)空白对照组 502±46.2* 425±43.5* 3.78±0.74*高血脂模型组 386±37.6 327±29.4 7.05±1.45阳性对照组 467±42.7* 406±41.8* 4.30±0.93*藠头总甾体皂苷低剂量组 426±33.1 351±28.1 5.77±1.10*藠头总甾体皂苷中剂量组 457±49.8* 382±43.3* 5.69±1.25*藠头总甾体皂苷高剂量组 482±40.3* 401±46.0* 5.29±1.12*

2.5 肝脏形态学观察 对各组大鼠的肝脏病理切片经400倍放大观察如图2所示。空白对照组少见脂肪滴存在。模型组肝细胞脂肪变性肿胀，肝细胞内含有大小不等的脂肪滴。洛伐他汀对照组可见少量小脂肪滴存在。藠头总甾体皂苷低剂量组可见比较多的小脂肪滴存在。藠头总甾体皂苷中剂量组可见相对模型组较少的脂肪滴。藠头总甾体皂苷高剂量组肝细胞内脂肪滴较模型组明显减少，多以小脂滴存在。以上结果说明藠头总甾体皂苷中、高剂量组能改善高血脂症大鼠的肝脏脂代谢，有效减少脂肪滴的产生，其结果与表1所测的血清学各项指标意义一致。

图2 藠头总甾体皂苷对高血脂症大鼠肝组织病理形态的影响 (400倍)Fig.2 Histopathological analysis of total steroidal saponins in the liver of the hyperlipidem ia rats(×400)

3 讨论

本实验以百合科葱属植物具有多种药理作用和保健功能为依据，对药食两用植物藠头在高脂血症上起的调节作用进行实验研究，结果表明藠头中甾体皂苷成分能有效调节高脂血症大鼠多项血脂水平，提高其体内部分脂肪分解酶及抗氧化酶水平，有效减少脂肪滴的产生，改善高血脂症大鼠的肝脏脂代谢。然而，仅以大鼠模型对藠头甾体皂苷成分进行实验研究还是不够的，如增加其他模型如转基因小鼠等进行深入研究，则对阐明藠头甾体皂苷成分调血脂的多靶点作用机理有积极意义，故在下一步研究中应予以重视。

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