香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤保护作用的研究

樊鑫梅， 曹文疆， 邢建国， 郭新红， 袁 勇， 王新春，*

(1.石河子大学药学院，新疆 石河子 832002;2.石河子大学医学院一附院，新疆 石河子832008;3.新疆维吾尔自治区药物研究所，新疆乌鲁木齐830004)

香青兰Dracocephalum moldavica L．为唇形科青兰属一年生草本植物［1］，维吾尔名为巴迪然吉布亚，临床应用具有抗血小板聚集、降低血液黏度、缓解冠心病、心绞痛等功效［2］。香青兰总黄酮(total flavones from Dracocephalum moldavica)为香青兰的主要有效成分［3-4］，近年来，本课题组前期研究工作表明，香青兰总黄酮具有明显的抗心肌缺血损伤、调节和改善心脏功能的作用［2，5-7］。因此，本试验采用经典的结扎大鼠左冠状动脉前降支致急性心肌缺血模型，旨在探讨香青兰总黄酮预处理对大鼠心肌缺血再灌损伤的保护作用及其可能的机制。

1 仪器与材料

1.1 仪器 HX—300动物呼吸机 (成都泰盟科技有限公司);BL—420E生物机能实验系统 (成都泰盟科技有限公司);倒置荧光显微镜 (日本OLYMPUS公司);power wave XS2酶标仪 (美国BIO-RAD公司);TDZ5—WS多管架自动平衡离心机 (湘仪离心机仪器有限公司);－80℃超低温冰箱。

1.2 药品与试剂 香青兰总黄酮提取物 (新疆维吾尔自治区药物研究所提供，纯度57%，批号20100626);复方丹参滴丸 (天津天士力制药股份有限公司，批号 110504);乳酸脱氢酶 (LDH)、肌酸激酶 (CK)、肌酸激酶同工酶 (CK-MB)、谷草转氨酶 (AST)、总超氧化物歧化酶 (T-SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px)、丙二醛 (MDA)和髓过氧化物酶 (MPO)测试盒均购自南京建成生物工程研究所;白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)Elisa试剂盒均购自美国R＆D公司;羧甲基纤维素钠(CMC-Na北京化学试剂公司，批号 20100803);戊巴比妥钠(北京化学试剂公司)。

1.3 动物 SPF级雄性SD大鼠，体质量 (250～300 g)，由新疆医科大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号:新医动字第2003－0001号。

2 试验方法

2.1 分组及给药 雄性SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只:假手术组、缺血再灌注组 (模型组)、香青兰总黄酮预处理组 ［高、中、低剂量分别为60、30、15 mg/(kg·d)］、复方丹参滴丸阳性药组 ［给药剂量为5丸/(kg·d)］。各给药组灌胃给药7 d，给药体积均为5 mL/kg体质量，每天1次。假手术组和模型组同时给予0.5%CMCNa灌胃，并于第8天给药后10 min后行手术。

2.2 心肌缺血再灌注损伤模型的制备 大鼠末次给药10 min后，戊巴比妥钠 (50 mg/kg)腹腔注射麻醉后，仰卧位固定。将银针电极插入四肢皮下，连接BL—420E生物机能实验系统，监测正常状态下肢体II导联心电图。颈部正中切口，分离气管，行气管插管，打开胸腔后接人工呼吸机(呼吸频率:60次/min，潮气量:2 mL/100 g，呼吸比为3∶2)，沿左锁骨中线切开皮肤2 cm，在第四五肋间打开胸腔，剪开心包，暴露心脏，稳定10 min后，在肺动脉圆锥左缘与左心耳下缘2 mm处进针，进针深度1～2 mm，宽度2～3 mm，经浅层心肌穿一3/8丝线。稳定5 min后，套上聚乙烯塑料套管，结扎，即完成左冠状动脉闭塞致心肌缺血。以心电图S-T段抬高、T波高耸标志心肌缺血成功;以抬高的S-T段下降、T波逐渐恢复以确定再灌注的成功［8-9］。实验结束后，腹主动脉取血，静置30 min后，离心 (0～4℃，3 000 r/min，10 min)，取上清放入－80℃冰箱冻存，用于血清学指标的测定。取血后迅速取下心脏置于冰生理盐水中，冲净心腔内血液，剪取结扎线以下的左心室组织冻存，用于制作组织病理切片。

2.3 观察指标及检测方法

2.3.1 大鼠缺血再灌期Ⅱ导联心电图S-T段变化用图像分析软件采集Ⅱ导联心电图S-T段变化，计算各药物组大鼠心电图在缺血和再灌注时S-T段变化绝对值［10］。

2.3.2 大鼠心肌组织病理形态学观察 取心尖部缺血心肌组织，置于10%多聚甲醛固定24 h，常规石蜡包埋，制成4μm厚石蜡切片，二甲苯脱蜡，苏木精-伊红 (HE)染色，梯度乙醇脱水，封片，于光学显微镜下观察。采用评分制评价组织细胞损伤程度:0分，没有损伤;1分 (轻度损伤)，间质水肿和局灶性坏死;2分 (中度损伤)，弥散性心肌细胞溶胀和坏死;3分 (严重损伤)，细胞融合性坏死并伴随中性粒细胞浸润;4分 (极严重损伤)，广泛的细胞融合性坏死，中性粒细胞浸润及出血［11］。

2.3.3 血清心肌酶的检测 检测各组血清中LDH、CK、CK-MB和AST的活性［8］，试验操作方法严格按照试剂盒说明书进行［12］。

2.3.4 血清氧化应激指标的测定 采用黄嘌呤氧化酶法测定SOD的活性，比色法测定GSH-Px的活性，硫代巴比妥酸法测定MDA水平，试验操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

2.3.5 炎症因子的测定 采用酶联免疫吸附法检测血清中 IL-1、IL-6和 TNF-α的水平［13］，比色法测定MPO的活性，操作方法严格按照试剂盒说明书进行。

2.3.6 统计学分析 采用SPSS 10.0统计学软件统计数据，所有实验数据均以±s表示，组间比较用t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。

3 实验结果

3.1 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤心脏Ⅱ导联心电图的影响 与假手术组比较，其余各组缺血期的S-T段明显抬高，而再灌注期的S-T段较缺血期有所降低，提示模型建立成功;与模型组比较，香青兰总黄酮高、中剂量组和丹参滴丸组在心肌缺血-再灌注 (IR)过程中S-T段抬高均显著低于模型组 (P＜0.05或P＜0.01)，说明香青兰总黄酮预处理能降低大鼠心肌缺血再灌注损伤(见表1)。

表1 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤心电图S-T段的影响 (±s，n=10)Tab.1 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on S-T segment in rats(±s，n=10)

表1 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤心电图S-T段的影响 (±s，n=10)Tab.1 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on S-T segment in rats(±s，n=10)

注:与假手术组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P ＜0.01

组 别 剂量/(mg·kg－1)S-T段/mv缺血后 再灌注后假手术组 － 0.13±0.03 0.12±0.04模型组 － 0.41±0.05△△ 0.36±0.07△△香青兰总黄酮 60 0.28±0.06＊＊ 0.25±0.06＊＊30 0.34±0.05* 0.29±0.07*15 0.39±0.06 0.34±0.06丹参滴丸组 135 0.22±0.04＊＊ 0.26±0.07＊＊

3.2 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌组织病理形态学的影响 常规HE染色后在光镜下观察，假手术组 (0分):心肌细胞排列整齐，界限清晰，呈束状分布，心肌细胞核形态正常，无细胞肿胀和坏死区;模型组 (4分):心肌广泛融合性病变，心肌细胞肿胀，肌纤维排列紊乱，大片状出血坏死，细胞间中性粒细胞浸润明显;香青兰总黄酮高剂量组及丹参滴丸组 (1分):仅见细胞有轻度水肿，肌纤维排列较为整齐，未见片状坏死;香青兰总黄酮中剂量组 (2分)、香青兰总黄酮低剂量组 (3分)，可见心肌细胞溶胀坏死并伴有中性粒细胞浸润 (见图1)。

图1 大鼠心肌缺血再灌注损伤心肌细胞组织病理学观察(HE×200)Fig.1 Histopathologic exam ination of ischem ia-reperfusion injury m yocardium in rats(HE×200)

3.3 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤血清心肌酶的影响 与假手术组比较，模型组血清心肌酶活性明显升高 (P＜0.01);与模型组比较，香青兰总黄酮可剂量依赖性的降低心肌缺血再灌注损伤大鼠血清中的心肌酶的活性，其中香青兰总黄酮高、中剂量组差异显著 (P＜0.01或P＜0.05)，与丹参滴丸组效果相当 (见表2)。

3.4 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤氧化应激的影响 与假手术组比较，模型组SOD及GSH-Px的活性明显降低 (P＜0.05或P＜0.01)，而MDA的水平显著升高 (P＜0.01);与模型组比较，香青兰总黄酮高、中剂量组和阳性药组血清SOD及GSH-Px的活性显著升高 (P＜0.05或P＜0.01)，而MDA的水平则明显下降 (P＜0.01)，此外，香青兰总黄酮低剂量组虽能提高SOD及GSH-Px的活性和MDA的水平，但不具有统计学意义 (见表3)。

表2 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤血清心肌酶活性的影响 (±s，n=10)Tab.2 Effects of total flavones from Dracocephalum moldavica on the activities of myocardial enzyme in rats serum(x ±s，n=10)

表2 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤血清心肌酶活性的影响 (±s，n=10)Tab.2 Effects of total flavones from Dracocephalum moldavica on the activities of myocardial enzyme in rats serum(x ±s，n=10)

注:与假手术组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 剂量/(mg·kg－1) LDH/(U·mL－1) CK/(U·mL－1)CK-MB/(U·mL－1) AST/(U·mL－1)假手术组 －0.15±0.06 0.48±0.23 0.53±0.29 0.21±0.05模型组 － 0.48±0.09△△ 0.87±0.37△△ 0.94±0.24△△ 0.35±0.07△△香青兰总黄酮高剂量组 60 0.28±0.12＊＊ 0.62±0.32＊＊ 0.78±0.31＊＊ 0.19±0.05＊＊香青兰总黄酮中剂量组 30 0.34±0.15＊＊ 0.71±0.26* 0.86±0.26* 0.26±0.06*香青兰总黄酮低剂量组 15 0.45±0.08 0.83±0.49 0.91±0.32 0.28±0.05*丹参滴丸组 135 0.26±0.17＊＊ 0.70±0.11＊＊ 0.69±0.43＊＊ 0.16±0.08＊＊

表3 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤血清氧化应激的影响 (±s，n=10)Tab.3 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on oxidant stress in rats serum(±s，n=10)

表3 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤血清氧化应激的影响 (±s，n=10)Tab.3 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on oxidant stress in rats serum(±s，n=10)

注:与假手术组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 剂量/(mg·kg－1) SOD/(U·mL－1) GSH-Px/(mmol·mL －1) MDA/(nmol·mL －1)假手术组 －113.2±15．6 1.92±0.15 2.73±0.55模型组 － 75.6±8．3△△ 1.63±0.12△△ 8.15±1.32△△香青兰总黄酮高剂量组 60 124.5±10．8＊＊ 1.98±0.20* 5.62±0.87＊＊香青兰总黄酮中剂量组 30 112.5±12．7＊＊ 1.85±0.14* 6.53±0.72＊＊香青兰总黄酮低剂量组 15 86.7±7．5 1.65±0.18 7.30±0.94丹参滴丸组 135 119.6±10．1＊＊ 1.87±0.09* 6.08±0.53*

3.5 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤血清炎症因子及炎症细胞的影响 与假手术组比较，模型组血清IL-1、IL-6、TNF-α水平及MPO活性明显升高 (P＜0.01);与模型组比较，香青兰总黄酮各剂量组和丹参滴丸组均能降低上述炎症因子水平及炎症细胞浸润程度，并且具有一定的量效关系，其中，香青兰总黄酮高剂量组与模型组具有显著性差异 (P＜0.05或P＜0.01)(见表4)。

表4 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤炎症反应的影响 (±s，n=10)Tab.4 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on inflammatory factor in rats(±s，n=10)

表4 香青兰总黄酮对大鼠心肌缺血再灌注损伤炎症反应的影响 (±s，n=10)Tab.4 Effect of total flavones from Dracocephalum moldavica on inflammatory factor in rats(±s，n=10)

注:与假手术组比较，△△P＜0.01;与模型组比较，*P＜0.05，＊＊P＜0.01

组 别 剂量/(mg·kg－1) IL-1/(pg·mL－1) IL-6/(pg·mL－1) TNF-α/(pg·mL－1) MPO/(U·L－1)假手术组 －4.52±0.87 9.53±1.24 25.6±7．29 35.40±3.1模型组 － 18.3±2.52△△ 27.8±6.52△△ 40.5±9．53△△ 224.87±6.5△△香青兰总黄酮高剂量组 60 12.6±3.21* 19.5±6.64* 31.6±11．2* 42.20±5.9＊＊香青兰总黄酮中剂量组 30 14.8±4.57 23.2±9.47 36.5±8．72 83.82±8.0＊＊香青兰总黄酮低剂量组 15 18.5±4.85 25.6±8.33 38.2±9．54 98.82±8.3*丹参滴丸组 135 11.8±2.28* 24.3±5.36* 32.4±12．2* 51.37±8.5＊＊

4 讨论

大鼠心肌缺血再灌注损伤时心肌细胞凋亡坏死，心肌组织中的LDH、CK、CK-MB和AST会漏出心肌细胞入血，致使血清中的心肌酶活力明显升高，因此，血清心肌酶活性的高低，直接反映缺血心肌细胞的损伤程度。实验中发现，香青兰总黄酮可以剂量依赖性的抑制血清心肌酶的活性，提示其能够通过提高细胞膜的稳定性而发挥心肌保护作用;组织病理学检查进一步说明香青兰总黄酮能够减轻心肌细胞坏死程度，缩小病变范围，从而改善心肌功能。

在心肌缺血再灌注损伤过程中，氧化应激及炎症损伤贯穿于心肌细胞损伤的全过程，且能够渗透到其它损伤因素中发挥作用。在缺血再灌注过程中，氧化应激刺激缺血的心肌细胞产生大量的炎症因子，导致中性粒细胞被激活而不断浸润于心肌细胞中，诱导自由基大量产生，而SOD及GSH-Px等抗氧化酶类消耗增加，使活性氧的生成和清除的平衡被打破，从而激发心肌细胞的脂质过氧化损伤。本实验研究发现，香青兰总黄酮除了能够降低MDA的水平并提高抗氧化酶的活性，还能够抑制炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的水平，同时对中性粒细胞特征酶MPO的活性也具有很强的抑制作用。可见，香青兰总黄酮发挥抗心肌缺血再灌注损伤的作用可能是先抑制氧化应激反应，使炎症因子IL-1、IL-6、TNF-α的释放减少，从而降低了心肌细胞中中性粒细胞的浸润，进而减少氧自由基的生成，促使自由基的生成和清除的平衡得以恢复，形成一个良性循环，最终达到保护心肌的作用。

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