抗菌肽对海兰褐仔公鸡小肠黏膜形态结构及免疫活性细胞数量的影响

刘莉如 杨开伦 滑 静 王晓霞 刘亭婷

(1.新疆农业大学动物科学学院，乌鲁木齐 830052;2.北京农学院动物科学技术学院，北京 102206;3.首都师范大学，北京 100048)

当前，细菌性感染和细菌性疾病呈上升趋势，耐药性细菌，如耐药性结核杆菌、大肠杆菌和被称为“超级细菌”耐甲氧西林金葡菌(MRSA)等对人和动物造成的危害日趋严重，这种现状急需改善，而抗菌肽(antimicrobial peptides，ABPs)对细菌具有强烈的抑制作用，在饲料中长期添加抗菌肽，细菌不易获得耐药性，使用效果稳定，属无毒副作用、无残留、无致细菌耐药性的一类环保型饲料添加剂。可以通过向海兰褐仔公鸡基础饲粮中添加天蚕素抗菌肽(cecropin)，达到彻底替代饲用抗生素的使用的目的，对降低抗生素残留，生产绿色、安全、营养的畜禽产品，促进健康养殖的发展具有重要意义。前人对抗菌肽的研究主要集中在分离纯化、鉴定、抗微生物活性等方面，在动物生产方面，尤其在海兰褐仔公鸡黏膜免疫方面的研究，目前罕见报道。有关在饲粮中分别添加适量抗生素和不同水平抗菌肽，研究两者对海兰褐仔公鸡各试验指标的影响，进一步比较畜禽饲粮中抗菌肽与抗生素的添加效果，进而确定适宜添加量的文献更是鲜见。为此，本文旨在通过在海兰褐仔公鸡饲粮中添加不同水平天蚕素抗菌肽，研究其对小肠黏膜形态结构、免疫活性细胞数量的影响，为进一步研究提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所用天蚕素抗菌肽主要成分为枯草芽孢杆菌，含量≥1×109CFU/g，由国家饲料工程技术研究中心研制，北京中农颖泰生物技术有限公司生产。试验所用抗生素为金霉素。

1.2 试验动物与饲养管理

试验选用336只1日龄海兰褐仔公鸡(购自北京农业职业技术学院种鸡场)，平均体重为(39.14±0.17)g，3层笼养。饲喂期内，试验鸡只自由采食饮水，其他免疫和消毒措施遵照鸡场正常程序进行，每天观察鸡群健康状况，并记录试验数据。饲养试验在中国农业科学院南口中试基地鸡舍进行。

1.3 试验分组设计

将试验选用的336只1日龄健康海兰褐仔公鸡随机分为7个处理(表1)，每个处理4个重复，每个重复12只鸡，各处理初始体重差异不显著(P＞0.05)。饲养试验期为42 d。

1.4 试验饲粮

以玉米-豆粕型饲粮为基础饲粮，饲粮按鸡饲养标准(NY/T 33—2004)配制。

表1 试验设计Table1 Experimental design

表2 基础饲粮组成及营养水平(风干基础)Table2 Composition and nutrient levels of the basal diet(air-dry basis) %

1.5 组织切片制作方法

组织切片制作方法为:1)取材及固定;2)修块;3)脱水、硬化;4)透明;5)浸蜡;6)包埋;7)塑型和切片;8)展片;9)烘片;10)染色。

1.6 常规苏木精-伊红(HE)组织染色程序流程

常规HE组织染色程序流程为:1)组织切片常规脱蜡[二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ、二甲苯∶无水乙醇(1∶1)，5 min];2)无水乙醇和梯度酒精下行(无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ，5 min→95%、80%、70%酒精，2 min);3)苏木精染色，6 min;4)蒸馏水漂洗，1 min;5)1%盐酸酒精分色，5 s;6)自来水蓝化，25 min;7)伊红染色，3 s;8)梯度酒精上行(70%、80%酒精，2 min)，95%酒精、无水乙醇Ⅰ、无水乙醇Ⅱ，5 min;9)透明[二甲苯∶无水乙醇(1∶1)、二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ，5 min];10)封固为中性树胶封片。

1.7 糖原及多糖高碘酸-Schiff氏液(PAS)染色程序流程

PAS染色程序流程为:1)石蜡组织切片，常规脱蜡程序同HE组织染色程序流程1)～2)步骤;2)蒸馏水过洗2次;3)高碘酸氧化液处理10 min;4)充分蒸馏水洗;5)Schiff氏液染色10 min;6)流水冲洗30 s至2 min，对于着色较深的切片可适当缩短时间;7)用Mayer明矾-苏木精液染细胞核3～5 min;8)0.5%盐酸乙醇液分化30 s;9)自来水浸洗2 min;10)无水乙醇Ⅰ，5 min;11)无水乙醇Ⅱ，5 min;12)二甲苯∶无水乙醇(1∶1)，5 min;13)二甲苯Ⅰ，5 min;14)二甲苯Ⅱ，5 min;15)封固为中性树胶封片。

待中性树脂干燥后，用光学显微镜进行观察。观察海兰褐仔公鸡小肠黏膜基本形态结构;其中，HE染色观察肠黏膜上皮内淋巴细胞，PAS染色观察杯状细胞。

1.8 组织切片读取方法

在OLYMPUS生物显微镜10倍光学显微镜下进行石蜡切片的观察、取图，在组织切片上选取典型视野进行拍照，使用Motic 2.0通用图像分析软件测量小肠绒毛高度、隐窝深度、黏膜厚度以及肌层厚度，观察和测量海兰褐仔公鸡十二指肠、空肠和回肠上皮内淋巴细胞、杯状细胞的分布和数量。

1.9 数据处理及统计分析

利用Excel软件对各重复原始数据进行处理，采用SPSS 17.0软件ANOVA进行显著性分析，并采用Duncan氏法进行多重比较。测定结果以“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 抗菌肽对海兰褐仔公鸡小肠黏膜形态结构的影响

由图1可以看出，经HE染色后，光镜下观察，添加量为350 mg/kg的抗菌肽Ⅴ组海兰褐仔公鸡小肠黏膜结构较为完整，层次分明，肠黏膜上皮表面的纹状缘结构清晰，肠绒毛排列较紧密。肠黏膜上皮细胞轮廓清晰，排列紧密，染色鲜明。柱状细胞呈高柱状，单层排列，胞浆丰富，胞核椭圆形，位于细胞基部。杯状细胞呈现高脚杯状，分散在柱状细胞之间。而对照组的黏膜结构不够完整，偶见肠绒毛顶端脱落现象，有的绒毛较细，尤其是十二指肠。

图1 抗菌肽Ⅴ组空肠黏膜形态结构显微照片Fig.1 Photomicrographs of mucosal morphology of jejunum in ABPs groupⅤ

2.1.1 抗菌肽对海兰褐仔公鸡十二指肠黏膜形态结构的影响

由表3可以看出，随着饲粮中天蚕素抗菌肽添加量的不断增加，十二指肠绒毛高度呈现升高趋势，其中抗菌肽Ⅴ组十二指肠绒毛高度显著高于对照组、抗生素组、抗菌肽Ⅰ组(P＜0.05)，与对照组、抗生素组相比分别提高了24.88%和19.52%。抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间绒毛高度不存在显著性差异(P＞0.05)。

十二指肠隐窝深度各处理之间不存在显著性差异(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组十二指肠黏膜厚度显著高于其他各处理(P＜0.05)，分别比对照组提高了15.83%、25.74%，而其他各处理之间不存在显著性差异(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组十二指肠肌层厚度显著高于对照组、抗生素组(P＜0.05)，抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组和抗生素组与对照组差异不显著(P＞0.05)，各抗菌肽组之间同样差异不显著(P＞0.05)。但抗菌肽Ⅴ组肌层厚度数值最高，比对照组提高了64.98%，比抗生素组提高了37.43%。

2.1.2 抗菌肽对海兰褐仔公鸡空肠黏膜形态结构的影响

由表4可以看出，抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组空肠绒毛高度与对照组、抗菌肽Ⅰ组差异显著(P＜0.05)，与对照组相比，分别提高了19.51%、24.08%，但与抗生素组差异不显著(P＞0.05)。抗菌肽Ⅲ组显著高于对照组(P＜0.05)，但与抗生素组也差异不显著(P＞0.05)。抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间同样不存在显著性差异(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组空肠隐窝深度显著低于对照组、抗菌肽Ⅰ组(P＜0.05)，与抗生素组不存在显著性差异(P＞0.05)，抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间同样差异不显著(P＞0.05)。

抗生素组及抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组空肠黏膜厚度均显著高于对照组(P＜0.05)，且抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组也显著高于抗生素组和其他抗菌肽组(P＜0.05)，且抗菌肽Ⅴ组又显著高于抗菌肽Ⅳ组(P＜0.05)。

空肠肌层厚度各处理之间差异不显著(P＞0.05)。

表3 抗菌肽对仔公鸡十二指肠黏膜形态结构的影响Table3 Effects of ABPs on mucosal morphology of duodenum of young roosters μm

表4 抗菌肽对仔公鸡空肠黏膜形态结构的影响Table4 Effects of ABPs on mucosal morphology of jejunum of young roosters μm

2.1.3 抗菌肽对海兰褐仔公鸡回肠黏膜形态结构的影响

由表5可以看出，抗菌肽Ⅴ组回肠绒毛高度显著高于对照组、抗菌肽Ⅰ组(P＜0.05)，比对照组提高了13.31%，但与抗生素组之间不存在显著性差异(P＞0.05)，抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间差异不显著(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅴ组回肠隐窝深度显著低于对照组(P＜0.05)，且与抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组差异显著(P＜0.05)，与抗生素组不存在显著性差异(P＞0.05)，抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间同样差异不显著(P ＞0.05)。

抗菌肽Ⅴ组回肠黏膜厚度显著高于对照组、抗菌肽Ⅰ组(P＜0.05)，比对照组提高了20.86%，但与抗生素组之间不存在显著性差异(P＞0.05)，抗菌肽Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间差异也不显著(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组回肠肌层厚度显著高于对照组(P＜0.05)，分别比对照组提高了46.23%、52.60%，与抗生素组差异不显著(P＞0.05)，且各抗菌肽组之间不存在显著性差异(P＞0.05)，但肌层厚度有逐渐升高的趋势。

表5 抗菌肽对仔公鸡回肠黏膜形态结构的影响Table5 Effects of ABPs on mucosal morphology of ileum of young roosters μm

2.2 抗菌肽对海兰褐仔公鸡黏膜免疫相关细胞数量的影响

2.2.1 抗菌肽对海兰褐仔公鸡小肠上皮内淋巴细胞数量及分布的影响

HE染色结果显示，海兰褐仔公鸡十二指肠、空肠(图2)、回肠绒毛上均有上皮内淋巴细胞分布。上皮内淋巴细胞多位于上皮细胞基侧膜附近，少数位于上皮核层和顶层，以小型细胞为主，核大，呈圆形，深染，胞浆少。固有层内也有淋巴细胞分布。

图2 抗菌肽Ⅴ组空肠上皮内淋巴细胞形态结构显微照片Fig.2 Photomicrographs of morphology of intraepithelial lymphocytes in jejunum in ABPs groupⅤ

由表6可以看出，各抗菌肽组十二指肠上皮内淋巴细胞数量与对照组相比差异不显著(P＞0.05)，抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著高于抗菌肽Ⅱ组(P＜0.05)，与抗生素组之间不存在显著性差异(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅴ组空肠上皮内淋巴细胞数量显著高于对照组(P＜0.05)，而与抗生素组差异不显著(P＞0.05)，各抗菌肽组之间差异不显著(P＞0.05)，但上皮内淋巴细胞数量有逐渐增多的趋势。

回肠上皮内淋巴细胞数量各处理之间差异不显著(P＞0.05)。

上皮内淋巴细胞以小型细胞为主，胞核大而圆，深染，胞浆少。肠段不同，上皮内淋巴细胞数量差异很大。

由表6可以看出，海兰褐仔公鸡十二指肠上皮内淋巴细胞数量最多，空肠次之，回肠则数量最少。

2.2.2 抗菌肽对海兰褐仔公鸡小肠杯状细胞数量的影响

抗菌肽Ⅴ组空肠杯状细胞形态结构显微照片见图3。PAS染色呈桃红色阳性反应，杯状细胞分布于肠绒毛上皮细胞间，高脚杯状，顶部胞质为大量糖原颗粒拥塞而膨隆，底部纤细，有小而深染的不规则核与少量嗜碱性胞质。不同的肠段杯状细胞的数量也有所不同。杯状细胞的数量从十二指肠到回肠呈逐渐增多趋势。

由表7可以看出，抗菌肽Ⅴ组十二指肠杯状细胞数量显著高于对照组和抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.05)，与抗生素组差异不显著(P＞0.05)。抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间差异不显著(P＞0.05)，但杯状细胞数量有逐渐增多趋势。

抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组空肠杯状细胞数量显著高于对照组(P＜0.05)，抗菌肽Ⅴ组又显著高于抗生素组和抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.05)，抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组之间差异不显著(P＞0.05)。

抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组回肠杯状细胞数量显著高于对照组和抗生素组(P＜0.05)，且抗菌肽Ⅳ、Ⅴ组显著高于抗菌肽Ⅰ、Ⅱ组(P＜0.05)。

表6 抗菌肽对仔公鸡小肠上皮内淋巴细胞数量的影响Table6 Effects of ABPs on the number of intraepithelial lymphocytes in small intestine of young roosters 个

图3 抗菌肽Ⅴ组空肠杯状细胞形态结构显微照片Fig.3 Photomicrographs of morphology of goblet cells in jejunum in ABPs groupⅤ

3 讨论

3.1 抗菌肽对海兰褐仔公鸡小肠黏膜形态结构的影响

小肠是碳水化合物、脂肪、蛋白质等主要营养物质消化吸收的重要场所，小肠内黏膜结构与功能的完整性是养分消化吸收、动物正常生长和生产的基本保证，若肠黏膜发育不良或受损将严重影响动物的生长、发育及免疫功能等，所以维持正常的小肠结构与功能尤为重要。

绒毛形态的变化直接影响绒毛的表面积，进而影响机体吸收营养物质的能力。小肠绒毛变长、变粗或排列紧密会使小肠接触营养物质的面积增大，有利于微生物的定植和对营养物质的利用，从而促进小肠消化和吸收。微生物及其代谢产物能够引起肠壁厚度的增加，使更多的固有膜延伸到肠绒毛中央[1-2]。绒毛变短时，成熟的绒毛细胞减少，对养分的吸收能力低[3]，肠绒毛强劲有规律的摆动也有助于排斥有害菌群的定植。隐窝，即肠腺，是由绒毛基部的上皮陷入固有层内形成的管状腺体，隐窝内未分化细胞是绒毛细胞的再生来源，隐窝基部不断有细胞向绒毛顶部迁移、分化，形成具有吸收功能的绒毛细胞，以补充绒毛上皮的正常脱落，而隐窝深度则反映了细胞生成率。如果此过程减慢，则基部的细胞生成率降低，隐窝变浅。因而隐窝的深浅对保持肠绒毛的完整形态和正常机能有重要作用[4]，而黏膜的厚薄与营养物质的吸收和转运过程有关，由此影响小肠的吸收功能。Caspary[5]报道指出，绒毛高度增加后会使小肠接触营养物质的面积增大，从而增强小肠对营养物质的吸收。康静静等[6]研究结果表明，非洲鸵鸟皮肤抗菌肽可增强雏鸡的的消化吸收功能，从而促进雏鸡的生长发育以及改善雏鸡盲肠黏膜结构。Bao等[7]研究了猪抗菌肽(PABP)对肉仔鸡生产性能和肠道免疫的影响，结果表明，PABP处理的肉仔鸡体重和日增重显著增加，肠黏膜深度和厚度显著增加，血清碱性磷酸酶活性显著提高，血清分泌型免疫球蛋白A(SIgA)比例显著增加。本试验结果表明，除十二指肠隐窝深度、空肠肌层厚度各处理之间无显著性差异外，饲粮中添加不同水平天蚕素抗菌肽可不同程度地提高海兰褐仔公鸡小肠黏膜绒毛高度、黏膜厚度和肌层厚度以及降低隐窝深度，从而有效改善了其小肠黏膜结构。

表7 抗菌肽对仔公鸡小肠杯状细胞数量的影响Table7 Effects of ABPs on the number of goblet cells in small intestine of young roosters 个

3.2 抗菌肽对海兰褐仔公鸡小肠上皮内淋巴细胞数量的影响

作为肠道屏障的重要组成部分，肠黏膜机械屏障包括黏膜上皮、上皮之间的连接结构、上皮的基膜、细胞表面的细胞。上皮内淋巴细胞是肠黏膜免疫系统中最先接触抗原的免疫活性细胞，位于肠绒毛上皮细胞之间，在上皮内15%的细胞为淋巴细胞，上皮内淋巴细胞在肠道黏膜屏障中发挥重要的作用。马卫明[8]研究结果表明，猪小肠抗菌肽可以增加雏鸡肠道内上皮内淋巴细胞的数量，试验组鸡十二指肠、空肠和回肠上皮内淋巴细胞数量显著高于对照组。本试验结果表明，适量天蚕素抗菌肽可以增加蛋用仔公鸡十二指肠上皮内淋巴细胞数量，抗菌肽Ⅴ组空肠上皮内淋巴细胞数量显著高于对照组，各处理之间回肠上皮内淋巴细胞数量差异不显著，但随着天蚕素抗菌肽添加量的增加，其数量亦有逐渐增加的趋势，这与上述研究结果基本一致。另外本试验研究发现海兰褐蛋用仔公鸡十二指肠上皮内淋巴细胞数量最多，空肠次之，回肠则数量最少。

3.3 抗菌肽对海兰褐仔公鸡小肠杯状细胞数量的影响

杯状细胞能分泌黏液，对肠黏膜上皮可起到润滑保护和清除废物的作用，杯状细胞还可合成三叶状蛋白，通过聚合黏性糖蛋白来保护上皮细胞免受外部损害，以此加强宿主的防御能力，是构成肠道机械屏障的结构之一。马卫明[8]试验结果表明猪小肠抗菌肽可以显著提高鸡肠道组织杯状细胞的数量，增强鸡肠道黏膜机械屏障功能，提高鸡的肠道黏膜免疫能力。本试验结果表明，与对照组相比，抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组可显著提高海兰褐仔公鸡十二指肠、空肠及回肠各肠段杯状细胞数量，这与上述研究结果是一致的，表明天蚕素抗菌肽有效增强了宿主的防御能力。

4 结论

①除十二指肠隐窝深度、空肠肌层厚度各处理之间无显著性差异外，各抗菌肽组各肠段(十二指肠、空肠、回肠)绒毛高度、黏膜厚度、肌层厚度均得到了不同程度的提高，隐窝深度得到了不同程度的降低。抗菌肽Ⅴ组空肠上皮内淋巴细胞数量显著升高。抗菌肽Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组十二指肠、空肠及回肠杯状细胞数量显著升高。

②综合各指标来看，以抗菌肽Ⅴ组添加效果最好，天蚕素抗菌肽添加量为350 mg/kg。

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