枯草芽孢杆菌胞外酶对于玉米粉的修饰改性研究

李姝睿，牛春华，刘新凤，李 达，周宏璐，王景会*

(吉林省农业科学院，吉林 长春 130033)

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是美国食品及药物管理局（Food and Drug Administration，FDA）及我国卫生部都认定的安全菌种，更是当今工业酶的主要生产菌种之一[1]，主要用于生产淀粉酶、蛋白酶和脂肪酶[2]。尤其近年来的研究表明，其分泌的生物酶在玉米的生物改性中将发挥越来越重要的作用[3]。

淀粉及蛋白质是玉米粉的主要成分，蛋白质中氨基酸组成的变化及淀粉中直链淀粉与支链淀粉的数量、比例等都对玉米粉的食用及加工品质有重要影响[4]。实验主要研究了枯草芽孢杆菌胞外酶修饰改性前后玉米粉颗粒形态、结晶类型、淀粉及氨基酸的变化，以便于进一步探讨枯草芽孢杆菌胞外酶对于玉米粉修饰改性的原因及作用机理。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玉米粉：普通黄色凹齿玉米粉，吉林省农业科学院农产品加工研究所提供。

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）：吉林省农业科学院食品生物技术实验室分离鉴定并保存。

蛋白胨、酵母浸粉：北京奥博星生物技术有限责任公司；3，5-二硝基水杨酸（dinitrosalicylic acid，DNS）试剂：北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；氯化钠：北京化工厂；盐酸：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

HZQ-X100全温振荡培养箱：上海一恒科技有限公司；Evolution RC高速冷冻离心机：美国Thermo Stovall公司；WYT-32型手持式糖度计：泉州光学仪器厂；Varian Cary 300紫外可见分光光度计：澳大利亚PTY电器有限公司；JJ200电子天平：美国双杰公司；DHC-9023A电热鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；S-433D型全自动氨基酸分析仪：德国Sykam公司；JSM-6700F扫描电镜：日本Sanyo公司；XRD X-射线衍射仪：日本Rigaku Radiation Shield公司。

1.3 方法

1.3.1 枯草芽孢杆菌胞外酶对玉米粉的修饰改性

取在（Luria-Bertani，LB）琼脂平板上活化的枯草芽孢杆菌，接入LB液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养20h后离心，上清即为胞外粗酶液。然后，在上清液中加入10%的玉米粉（w/v）振荡处理10h取出，4℃、8000r/min离心10min，去上清，沉淀于45℃烘干粉碎，过100目筛待用。

1.3.2 生物酶修饰对于玉米淀粉颗粒形态的影响

将待测玉米粉样品均匀分布在粘有导电双面胶的样品台面上，真空条件下喷上一层铂金，然后固定于载物台上，在扫描电镜上观察淀粉颗粒的形态。

1.3.3玉米淀粉颗粒的X-射线衍射分析

采用粉末衍射法测定，分析测试条件设定为：特征射线CuKα，管流40mA，管压40kV，扫描速度12°/min，扫描范围2θ＝0°～80°。

1.3.4 淀粉，直链淀粉，支链淀粉含量的测定

准确称取玉米粉样品0.1000g，加入10mL0.5mol/LKOH，将上述烧杯置于60℃水浴中保温10min，并充分搅拌，然后用蒸馏水定容至50mL，摇匀，静置20min。取2.5mL上清，加入蒸馏水30mL，用0.1mol/L HCl将溶液pH值调至3.5，然后加入0.5mL碘试剂，最后用蒸馏水定容至刻50mL，静置30min，分别测定其吸光度值。

1.3.5 可溶性糖的测定

采用蒽酮法测定[5]。

1.3.6 还原糖的测定

采用3，5-二硝基水杨酸法测定[6]。

1.3.7 糊精的测定

准确称取玉米粉样品0.5g，加入5mL蒸馏水，搅拌均匀。50℃恒温水浴中保温20min，确保还原糖充分浸出，4℃、5000r/min离心10min，取1mL上清液，缓慢加入8mL 95%vol的乙醇，室温放置16h以上促使糊精沉淀。4℃、5000r/min离心8min，弃上清，沉淀加入蒸馏水10mL并搅拌均匀，然后加入1mL浓盐酸，121℃高压蒸煮30min，促使糊精基本上都水解为葡萄糖。冷却至室温后，用20%NaOH溶液中和，定容至15mL，然后依照上述还原糖的测定方法测定葡萄糖含量。

1.3.8 玉米粉中氨基酸的测定

参照参考文献[7]中饲料氨基酸的测定方法进行。

2 结果与分析

2.1 玉米淀粉颗粒的电镜观察

淀粉颗粒的大小、形状与其来源密切相关[8]，也影响着淀粉的功能。如小颗粒淀粉由于具有较大的表面积，消化速率就要快于大颗粒淀粉[9]。有研究发现[10]，破碎对于谷物淀粉颗粒的破坏程度极低，不足0.5%。图1为生物酶修饰前后玉米淀粉颗粒形态的电镜照片，可以看到玉米淀粉颗粒呈多边形，表面光滑。经过枯草芽孢杆菌胞外酶修饰后，淀粉颗粒表面形成明显酶作用后的孔洞，颗粒整体绝大部分依然保持完整，说明酶的修饰并没有引起淀粉颗粒崩溃，而是破坏玉米粉颗粒的表面结构，然后渗入淀粉颗粒内部[11]，通过改变淀粉的分子结构，分子取向等发生作用，进而改变玉米粉的品质[12-13]。

2.2 生物酶修饰改性玉米粉的X-射线衍射测定

X-射线是一种波长很短（约为（20～0.06）×10-8cm）的电磁波，当X-射线与物质相遇时，会产生一系列的效应，任何一种结晶的固体化合物由于该物质的内部结构特点的不同，都能够得到一套衍射峰位置及衍射强度完全不同的特征X-射线衍射图，这些衍射数据提供了该晶体许多的信息，如物相的定量、定性分析，晶体粒度大小和晶格的畸变等。目前，X-射线衍射分析已经成为研究晶体最方便、最重要的手段[14]。实验结果见图2。原玉米粉对照及各种微生物胞外酶修饰的玉米粉，基本都是在15°2θ及23°2θ附近位置分别有一个单的吸收峰，且在17°2θ和18°2θ附近位置有相连的双峰，这些均为A型晶体的特征吸收峰，说明生物酶的修饰并没有改变淀粉颗粒的晶体类型。

图1 微生物胞外酶修饰前(A)后(B)玉米粉中淀粉颗粒的电镜观察(2000×)Fig.1 Electronic microscope of corn starch particles before(A)and after(B)the modification by exocellular enzymes(2000×)

图2 生物酶处理前(A)后(B)玉米粉中淀粉颗粒的X-射线衍射图Fig.2 X-ray diffraction pattern of corn starch particles before(A)and after(B)the modification by exocellular enzymes

2.3 枯草芽孢杆菌胞外酶处理对玉米粉中淀粉及糖类的影响

玉米淀粉颗粒是由支链淀粉和直链淀粉2种高分子有序集合而成的，淀粉的组成即支链淀粉与直链淀粉的比例及直链淀粉的含量，对玉米粉的品质有很重要的影响[15]，实验结果见图3，枯草芽孢杆菌处理后玉米粉中淀粉和支链淀粉含量下降明显，分别由对照组的70.72%、53.41%下降为酶修饰后的46.82%和27.51%，降幅分别为33.78%和48.49%。而直链淀粉的相对含量略有增加，由对照组的17.41%上升为酶修饰后的19.31%，增幅为10.91%，这可能是由于枯草芽孢杆菌分泌的淀粉酶绝大部分是α-淀粉酶，主要作用于支链淀粉，导致淀粉和支链淀粉的含量骤减，而直链淀粉变化不大，所以相对含量略有增加，也可能是干物质减少所造成的浓缩效应。闵伟红等[16]通过对乳酸菌发酵大米淀粉的研究发现，乳酸菌发酵后大米淀粉中的直链淀粉含量增加，支链淀粉被降解，与本研究的结果类似。枯草芽孢杆菌分泌的淀粉酶可以将玉米粉中的淀粉分解成可溶性糖，由图4可知，随着淀粉的分解，枯草芽孢杆菌胞外酶修饰产物中可溶性糖含量由对照的12.33%上升为31.02%，增幅为151.58%；还原糖含量由对照的4.31%上升为9.22%，增幅为113.92%；糊精含量由对照的4.01%上升为12.81%，增幅为219.45%。

图3 枯草芽孢杆菌胞外酶处理前后玉米粉中淀粉组成的变化Fig.3 The change of starch components of corn flour before and after the modification by exocellular enzymes

2.4 枯草芽孢杆菌胞外酶处理前后玉米粉中氨基酸的变化

玉米粉经过枯草芽孢杆菌胞外酶修饰后，氨基酸的变化见表1，总氨基酸含量比对照增加了26.46%。其中，谷氨酸的含量增加比例最大，为84.57%，其次是酪氨酸增加了50%，赖氨酸增加了47.37%，丙氨酸增加了35.42%，缬氨酸增加了34.29%，苯丙氨酸增加了20.51%，异亮氨酸增加了13.79%，而精氨酸下降了28.57%。其余的氨基酸变化较小或基本上没有变化。在带有“*”的必需氨基酸中，仅有精氨酸的相对含量明显下降，其他7种都有所增加，赖氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸的相对含量增加都达到20%以上。

表1 枯草芽孢杆菌处理前后玉米粉中氨基酸含量的变化Table 1 The change of amino acids contents of corn flour beforeand after the modification by exocellular enzymes

3 结论

枯草芽孢杆菌胞外酶对于玉米粉的修饰，只是破坏了其表面结构，在淀粉颗粒表面造成明显的孔洞，并没有引起淀粉颗粒完全崩溃。同时，也没有改变淀粉颗粒的结晶类型。

玉米粉经过枯草芽孢杆菌胞外酶修饰后，其可溶性糖、还原糖及糊精含量都有显著增加。而总淀粉和支链淀粉含量下降明显，直链淀粉的相对含量略有增加。在氨基酸方面也是变化明显，尤其是8种必需氨基酸中，除精氨酸外，其余都是有所增加，这些改变对于玉米粉及其制品食用及加工品质的影响都还有待于进一步研究。

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