压力浸麦对大麦萌发中主要酶活力的影响

曲 晶, 尹 亚 辉, 安 文 涛, 田 中 乐, 苏 洪 旭, 赵 长 新

(1.大连工业大学 生物工程学院, 辽宁 大连 116034; 2.中粮麦芽(大连)有限公司, 辽宁 大连 116200)

0 引 言

大麦作为啤酒的主要原料越来越受到人们的关注。大麦发芽过程的主要酶类除了淀粉酶和蛋白酶外,还有植酸酶、多酚氧化酶等。植酸酶能降解植酸生成肌醇和无机磷等分子[1-2]。植酸酶活力的高低会影响大麦发芽的酸环境和金属离子的变化,进而影响其他酶的作用,从而影响麦芽品质[3-4]。多酚氧化酶是麦芽中的一种氧化还原酶[5],对啤酒的色泽、泡沫、风味和非生物稳定性有很大影响[6-7]。

大麦的制麦工艺在不断地探索研究中日益成熟,但大部分研究都是在常压的条件下进行的[8-10],对于在制麦过程中施加压力的探索鲜有报道。本实验通过在制麦的浸麦阶段施加不同的压力条件来研究大麦发芽过程中酶活力的变化,以期研究压力对大麦发芽的影响。

1 材料与方法

1.1 实验材料

大麦:加拿大大麦Metcalfe,中粮麦芽(大连)有限公司提供。

试剂:可溶性淀粉、柠檬酸、柠檬酸钠、乙酸钠、冰醋酸、钼酸铵、亚硫酸钠、对苯二酚、邻苯二酚、植酸钠、酪蛋白、碳酸钠、氢氧化钠、3,5-二硝基水杨酸、三氯乙酸等均为分析纯。

1.2 实验仪器

YQ-PJ-6B型自动糖化器,轻工业部西安轻机所光电公司；WFJ7200可见光分光光度计,尤尼柯(上海)仪器有限公司；ZPS-250H智能恒温恒湿培养箱,黑龙江东拓仪器制造有限公司；标准EBC麦芽粉碎机,德国制造；PB-10型pH计,德国赛多利斯。

1.3 实验方法

1.3.1 麦芽的制备

采用间歇浸麦的方式,并在浸麦阶段以常压为参照,分别施加0.05、0.10、0.15 MPa 3组压力。发芽温度16 ℃。常压和0.05 MPa培养至100 h到达发芽终点,0.10和0.15 MPa培养至124 h到达发芽终点。

1.3.2 酶液的制备

准确称取10.00 g麦芽,经过粉碎后倒入糖化杯内,加pH 5.0的醋酸-醋酸钠缓冲液10 mL,去离子水90 mL,40 ℃糖化锅内水浴搅拌1 h。离心(4 000 r/min)15 min,制得的上清液用来测定酶活力。

1.3.3 酶活力的测定

α-淀粉酶和β-淀粉酶活力的测定方法详见参考文献[11]；植酸酶活力的测定方法详见参考文献[12]；蛋白酶活力的测定方法详见参考文献[13]；多酚氧化酶活力的测定方法详见参考文献[14-15]。

酶活力测定的取样时间从浸麦开始,分别为6.5、18.5、24、28、52、76、100、124 h。

2 结果与分析

2.1 压力对植酸酶活力影响

由图1可知,大麦萌发过程中,植酸酶的活力有明显的上升趋势。常压组和0.05 MPa组达到酶活力最大值的时间相同,且酶活力较高；而0.10 和0.15 MPa组推后24 h达到酶活力最大值,且最大酶活力相对较低。在发芽开始阶段,0.05 MPa 组的植酸酶活力低于常压组,但40 h左右开始,0.05 MPa组的植酸酶活力略高于常压组,且升高速度较快。这可能是由于较低的压力对植酸酶空间结构影响不大,压力撤除后酶活力恢复较快的缘故,而较大的压力对植酸酶的空间结构影响较大,恢复酶活力所用的时间较长,并且在整个过程中植酸酶活力的大小也受到明显的影响。

综上所述,压力并没有改变植酸酶酶活力的变化趋势,但对酶活力的大小和酶活力升高的速度产生一定的影响。

图1 大麦发芽过程中不同压力下植酸酶活力的变化

Fig.1 Change of phytase activity in barley germination process under different pressures

植酸酶活力的高低对其他酶类的作用也产生重要的影响。植酸酶水解植酸过程中,释放的金属离子对其他酶的活力可能产生激活作用。例如释放的Ca2+是稳定α-淀粉酶结构的重要金属离子,对α-淀粉酶的活力有激活作用。释放的Mg2+和Ca2+是蛋白酶的激活剂。植酸酶水解过程中释放的磷酸盐具有很好的缓冲作用,调节发芽过程中的pH,进而对酶活力的作用环境产生影响。

2.2 压力对α-淀粉酶活力的影响

由图2可知,在大麦发芽过程的浸麦阶段压力对α-淀粉酶活力的影响很小。发芽4 h后,α-淀粉酶开始快速合成,28～52 h过程中,常压的α-淀粉酶活力上升最快,52～76 h 0.05 MPa组上升最快,并在76 h略高于常压组酶活力,0.15和0.10 MPa组酶活力低于前两组,且0.15 MPa组相对较高。100～124 h,0.15和0.10 MPa组α-淀粉酶活力有明显的提高。

图2 大麦发芽过程中不同压力下α-淀粉酶活力的变化

Fig.2 Change of α-amylase activity in barley germination process under different pressures

α-淀粉酶活力的变化与赤霉素含量的变化趋势是一致的,并且植酸酶释放的Ca2+对酶活力的提高也有帮助。这体现为52～76 h,0.05 MPa组的α-淀粉酶活力提高速度最快,且在76 h处酶活力略高于常压组。100～124 h酶活力的提高主要是赤霉素含量在此阶段有所提高的缘故。

2.3 压力对蛋白酶活力的影响

由图3可知,在发芽的开始阶段,即24～40 h左右,常压组和0.05 MPa组的蛋白酶活力均有显著的上升,但常压组的蛋白酶活力相对较高。在40～60 h阶段,0.05 MPa组的酶活力上升速度超过常压组,且酶活力最大值高于常压组的蛋白酶活力。这一现象可能由于压力对酶构象影响以及构象恢复有关,同时也与植酸酶对Mg2+和Ca2+的释放有关。

图3 大麦发芽过程中不同压力下蛋白酶活力的变化

Fig.3 Change of protease activity in barley germination process under different pressures

从整体来看,常压组和0.05 MPa压力组的蛋白酶活力变化趋势相似,都是在52 h处蛋白酶活力达到最大值,且平均水平高于后两组。而0.10 和0.15 MPa组的蛋白酶活力最大值出现在76 h处。产生这一现象的原因一方面是赤霉素的影响,另一方面可能是由于较高的压力对蛋白酶构象产生的影响较大,因而影响了蛋白酶的活力,压力被撤除后,受影响较大的实验组的酶的构象恢复相对较慢,因而酶恢复活力达到最大值的时间向后推迟。

2.4 压力对β-淀粉酶活力的影响

由图4可知,在未发芽以前,大麦中β-淀粉酶具有一定的活力。且在浸麦和发芽的开始阶段,β-淀粉酶活力基本处于稳定状态,在52 h处,常压组和0.05 MPa压力组的β-淀粉酶活力开始有显著增加,并在76 h处达到酶活力的最大值；而0.10 MPa组和0.15 MPa组在76 h处酶活力才开始显著增加,在100 h处酶活力达到最大值,并且0.10 MPa组的最大酶活力高于0.15 MPa组。

图4 大麦发芽过程中不同压力下β-淀粉酶活力的变化

Fig.4 Change of β-amylase activity in barley germination process under different pressures

这一现象可能是由于β-淀粉酶活力的提高依赖于蛋白酶水解二硫键释放出游离态有活力的β-淀粉酶。因而β-淀粉酶活力显著增加的时间滞后于蛋白酶活力增加的时间。而0.10 MPa组的蛋白酶活力在最大值处高于0.15 MPa组的蛋白酶活力,这可能是0.10 MPa组的游离态β-淀粉酶含量较0.15 MPa组高,因而表现出的酶活力较高。

从整个发芽过程看,4组实验中β-淀粉酶活力的平均水平按从高到低的顺序排列为:0.15 MPa组、0.10 MPa组、0.05 MPa组、常压组。因此可以看出,较高的压力有利于发芽过程中β-淀粉酶活力的提高。这可能是因为压力的增加使β-淀粉酶外表面与水分子之前形成的氢键数量增加[16],而β-淀粉酶分子内的氢键相应减少,从而降低了β-淀粉酶肽链的刚性,因而提高了β-淀粉酶的活性的缘故。

2.5 压力对多酚氧化酶活力的影响

由图5可以看出,多酚氧化酶活力在大麦发芽过程中呈上升的趋势。在发芽刚开始的阶段,即24～28 h,除0.10 MPa组外,多酚氧化酶活力在其他组中的变化不明显。从28 h开始,多酚氧化酶活力在各组中都上升较快,常压组在52 h处多酚氧化酶活力达到最大值,并且与0.05 MPa组和0.15 MPa组在52 h处的酶活力大小相近。而其余各组的多酚氧化酶活力在76 h处又开始迅速上升,并且均在100 h处达到多酚氧化酶活力的最大值,且明显高于常压组的最大值水平。

从图5可以得出,压力的作用可以使麦芽中的多酚氧化酶活力得到提高。多酚氧化酶使多酚物质发生氧化、聚合后可以与蛋白质形成沉淀,在啤酒后期的制造中被过滤除去,从而能够提高啤酒的非生物稳定性。加压能够提高多酚氧化酶活力,对啤酒生产有利。

图5 大麦发芽过程中不同压力下多酚氧化酶活力的变化

Fig.5 Change of polyphenol oxidase activity in barley germination process under different pressures

3 结 论

本实验通过在浸麦过程的浸水阶段施加压力,比较压力组与常压组酶活力的不同变化,进而研究压力对大麦发芽过程主要酶活力的影响。

结果表明,浸麦过程中施加的压力对大麦萌发过程的主要酶活力的影响主要体现在两方面:一是对酶活力变化趋势的影响。施加压力,酶活力的整体变化趋势基本不变,但在一定范围内压力的提高,酶活力变化趋势随时间有向后推移的现象;二是不同压力对同一时刻的酶活力的大小有显著的影响。从整体水平来看,随着压力在一定范围内的提高,植酸酶、α-淀粉酶、蛋白酶活力有所降低,但β-淀粉酶和多酚氧化酶的活力有所提高。

[1] 祁艳霞,陈玉林. 植酸酶的作用机理及影响植酸酶活性的因素[J]. 饲料博览, 2004(7):10-11.

[2] 刘梅,王林云,史挺,等. 植酸酶的研究进展[J]. 辽宁畜牧兽医, 2003(2):35-36.

[3] FUJITA J, BUDDA N, TUJIMOTO M, et al. Isolation and characterization of phytase isozymes produced byAspergillusoryzae[J]. Biotechnology Letters, 2000, 22(22):1797-1802.

[4] ASMAR F. Variation in activity of root extracellular phytase between genotypes of barley[J]. Plant and Soil, 2001, 195(1):61-64.

[5] 曾文忠,曾婷. 浅论啤酒酿造中的酚类物质[J]. 啤酒科技, 2006(2):10-12.

[6] 衣艳萍,范亚君,刘庆杰. 论多酚物质对啤酒质量的影响及控制[J]. 酿酒, 1998(3):33-35.

[7] 胡彦营. 啤酒中的酚类物质及其与啤酒质量的关系[J]. 济宁师范专科学校学报, 2006, 27(6):17.

[8] 李秀琳,李晓军,董亮,等. 国产啤酒大麦发芽过程中主要水解酶活力变化[J]. 食品科技, 2009, 34(9):163-167.

[9] 刘乃侨,孙丽华. 国产啤酒酿造过程酶活力方法的研究[J]. 微生物学杂志, 2011, 31(5):73-75.

[10] 陈霞,韩丹,莫新迎,等. 国产大麦主要酿造特性与成品麦芽品质的关系[J]. 食品科技, 2010, 35(8):129-133.

[11] 李珊. 啤酒大麦制麦过程中淀粉酶系及其酶活力的研究[D]. 青岛:中国海洋大学, 2009:19.

[12] 郭建华,赵长新,孙丽华,等. 大麦萌发时植酸酶酶学特性及形成机理的初步研究[J]. 河南工业大学学报:自然科学版, 2006, 27(1):15-17.

[13] 中山大学. 生物化学导论[M]. 北京:人民教育出版社, 1978:25-28.

[14] 孙丽华,李秀林,赵长新,等. 大麦发芽过程中多酚氧化酶酶学特性初步研究[J]. 中国酿造, 2008(7):35-38.

[15] 李忠光,龚明. 植物多酚氧化酶测定方法的改进[J]. 云南师范大学学报, 2005, 25(1):44-49.

[16] 李宗军,方武,徐建兴. 高压生物科学与技术研究进展[J]. 生物物理学报, 2004, 20(1):1-5.