柠檬醛 肉桂醛 丁香酚抑制耐氟康唑白色念珠菌机理的试验

王贵强，孙莎莎，范 开，林德贵

（1．中国农业大学动物医学院，北京 海淀100193；2．北京生泰尔生物科技有限公司，北京 昌平102206）

白色念珠菌是一种人畜共患真菌病，能引起人和动物内脏、皮肤以及黏膜的感染［1］。西药曾在白色念珠菌病的治疗中发挥过举足轻重的作用，但是，由于抗真菌药的广泛应用，真菌对抗真菌药物尤其是唑类药物的耐受性逐渐增强，大量耐药菌株的出现使得白色念珠菌病的治疗越来越困难。而且，现有抗真菌药存在的毒副作用一直未能解决。寻求一种更加安全可靠的途径来解决真菌感染，已成为医学界的强烈呼唤。

中药治病在中国已有几千年的历史，我国科学家经过几十年的探索，发现许多中药具有抗真菌作用，并分离得到了多种有效化学成分［2］。柠檬醛、肉桂醛、丁香酚具有较强的抗白色念珠菌作用，本试验将这3种药物作用于耐药型白色念珠菌菌株，通过电镜观察这3种药物对白色念珠菌菌体的作用效果，并利用气相色谱－质谱联用仪（GC－MS）检测白色念珠菌细胞膜甾醇合成的变化，来揭示这3种中药提取物抑制白色念珠菌的机理。

1 材料与方法

1．1 试验菌株 耐氟康唑白色念珠菌菌株（分离自中国农业大学动物医院并经培养鉴定）。

1．2 药物 柠檬醛、肉桂醛、丁香酚，均购自中国药品生物制品检定所。

1．3 培养基 RPMI－1640液基，按 NCCLS［3］方案推荐方法配制。

1．4 抗真菌药物稀释液制备 将中药提取物用二甲基亚砜（DMSO）根据不同药物的溶解度不同进行10倍或50倍溶解稀释，再用RPMI－1640培养液进行100倍稀释，使DMSO的终浓度＜1%，经对照试验该浓度DMSO对白色念珠菌生长无明显影响。

1．5 扫描电镜样品制备 将耐氟康唑白色念珠菌临床分离株35℃活化24h，分别用64．0mg／L的柠檬醛、16．0mg／L 的肉桂醛和64．0mg／L的丁香酚作用12h；取未经药物处理的上述菌株孵育12h作为对照组。分别将各组菌体细胞洗涤离心3次，先后经固定、脱水、临界点干燥、装台粘胶及喷金处理后，通过扫描电镜观察［4］。

1．6 细胞膜甾醇成分分析－GC／MS检测（气相色谱－质谱联用） 从SDA平板上挑取耐药型白色念珠菌单克隆菌落接种于1mL RPMI－1640培养基，35℃，200r／min振荡培养24h后，同样条件下连续传代2次，培养16h。分别取菌液1mL于含150 mL RPMI－1640培养液的250mL锥型瓶中，各加入柠檬醛、肉桂醛和丁香酚，使其终浓度分别为50．0mg／L、12．5mg／L、50．0mg／L，空白对照组不加药。35℃，200r／min振荡培养，时间不低于48 h，直至获得足够的菌量。2 000r／min离心5min，PBS洗涤3次至上清无色，弃上清，室温风干10 min后，分别称取不同药物作用后的白色念珠菌1．0g于50mL无塞玻璃管中，加PBS 5mL和新鲜制备的皂化剂12mL，混匀，80℃水浴皂化60min冷却至室温。加石油醚（沸程30℃～60℃）10mL，涡旋混匀1min，提取3次后合并提取液，加水10 mL涡旋混匀洗涤，移去水层。醚层在60℃水浴挥干，得未皂化脂，加环己烷0．9mL混匀后加封保鲜膜放置于4℃冰箱备用。

1．7 GS／MS参数 取上述提取的未皂化脂少量用于GC／MS检测，具体检测条件如下：（1）检测仪器：Finnigan Voyager气相色谱－质谱联用仪。（2）色谱柱：VF－5ms石英毛细管柱（30m×0．25mm×0．25 mm）。（3）柱温：200℃（保持2min）～300℃（保持15min）。（4）升 温 速 度：20℃／min，汽 化 温 度250℃。（5）载气（流量）：He（1．0mL／min），分流比：15∶1，1．0μL样品。（6）质谱检测器：EI源，电子能量70Ev，源温200℃。（7）标准库：NIST库2．3细胞膜甾醇成分分析结果

2 结果

2．1 扫描电镜结果 经过一定处理后，各组白色念珠菌菌体扫描电镜结果（见图1）。对照组，白色念珠菌菌体光滑完好，轮廓清晰（A）。柠檬醛组，可见菌体表面出现凹陷，空洞，菌体由椭圆形变得扁平（B）。肉桂醛组，菌体明显损伤，出现变形、残缺，甚至出现菌体碎片（C）。丁香酚组菌体未出现明显变形或损伤，但菌体表面粗糙，附有大量异物（D）。

2．2 细胞膜甾醇成分分析结果 本试验采用气相色谱－质谱联用的方法检测各种药物处理后白色念珠菌甾醇成分的变化，初步探讨了3种中药提取物对麦角甾醇生物合成通路上的作用靶点。结果表明，对照组（图2）以麦角甾醇（b）为主峰，另有两种细胞膜合成过程中的重要中间产物角鲨烯（a）、羊毛甾醇（c）。经过柠檬醛、肉桂醛、丁香酚处理后的白色念珠菌，麦角甾醇含量与对照组相比，分别变为对照组的9．19%、33．49%、74．36%。同样，羊毛甾醇的含量也出现了较大变化，柠檬醛组（图3）峰面积显著上升，占对照组面积的284．72%，肉桂醛组（图4）占对照组109．32%，丁香酚组（图2）占对照组111．69%。同时，柠檬醛组出现了新峰（d、g、f、h），肉桂醛组出现新峰（d、e）。我们由此可以得出结论，柠檬醛阻碍了白色念珠菌细胞膜上羊毛甾醇向麦角甾醇的转化，导致麦角甾醇合成减少，而麦角甾醇的前体羊毛甾醇在真菌细胞内大量积累，同时产生了大量的其他中间产物，从而发挥抑制耐药型白色念珠菌的作用。肉桂醛组麦角甾醇的合成明显减少，同时出现了（d、e）两个新峰，但羊毛甾醇含量并未见明显增加。柠檬醛组角鲨烯变为对照组的94．97%，肉桂醛、丁香酚组角鲨烯均没有出现明显的药峰。

3 讨论

西药治疗真菌病已有几十年的历史，曾经取得过辉煌的成绩。白色念珠菌病是最为常见的真菌病之一，然而，现在临床上出现了越来越多的耐氟康唑、酮康唑的白色念珠菌菌株［5］，使得传统药物的治疗效果大大降低。中药具有副作用小、不易产生耐药性等优点，且经过试验研究，很多中药抑菌、杀菌效果明显。本试验即证实柠檬醛、肉桂醛对耐氟康唑白色念珠菌具有较好的抑制作用，并揭示了其抑菌机理。

电镜研究结果显示，经柠檬醛作用后，耐药型白色念珠菌表面出现了明显的凹陷，菌体由原来的椭圆形变得扁平，菌体中间有空洞。而经过肉桂醛作用后，白色念珠菌菌体出现明显变形，甚至可以见到菌体碎片，这与之前柠檬醛、肉桂醛作用于白色念珠菌的研究基本一致，说明柠檬醛、肉桂醛对耐药型白色念珠菌同样具有较好的破坏作用。气相色谱－质谱检验发现，柠檬醛组细胞膜麦角甾醇含量显著降低，同时羊毛甾醇含量急剧上升。因麦角甾醇是真菌细胞膜的特有成分，麦角甾醇缺乏以及甾醇前体累积会导致真菌细胞膜的破裂［6］，由此我们推测，柠檬醛可能阻断了白色念珠菌细胞膜上羊毛甾醇到麦角甾醇的合成，使得羊毛甾醇大量积累，麦角甾醇合成显著减少，导致了白色念珠菌细胞膜的破坏。同时其他药峰的出现，进一步验证药物阻断了羊毛甾醇到麦角甾醇合成通路，导致中间产物大量积累，具体中间产物成分如何，还需要进一步研究。肉桂醛对白色念珠菌细胞膜甾醇成分亦有较大影响，主要是导致麦角甾醇含量显著降低，我们由此可以推测，肉桂醛发挥抑菌作用的机制可能是直接与细胞膜上的麦角甾醇发生作用，从而破坏细胞膜稳定性，达到抑制白色念珠菌的目的。

因麦角甾醇是真菌细胞膜的独特组成成分，而柠檬醛、肉桂醛对其有着非常有效的作用效果，能大量减少麦角甾醇的合成。因此，我们认为，柠檬醛和肉桂醛作为抗真菌药有很大的研发前景。

［1］ Barnes R A，Denning D W，Evans E G，etal．Fungal infections：a survey of laboratory services for diagnosis and treatment［J］．Commun Dis Rep CDR Rev，1996，6（5）：69－75．

［2］ 夏忠弟，杨军祥，李沛涛．山苍子油抗白色念珠菌的机制研究［J］．湖南医科大学学报，1995，20：107－108．

［3］ National Committee For Clinical Laboratory Standard．Reference method for broth dilution antifungal susceptibility testing of yeast［J］．Tentative standard M 27－T．Pennsylvania：NCCLS，1995，1－22．

［4］ 谢小梅，龙 凯，方建茹，等．肉桂醛、柠檬醛抑制黄曲霉生长机制研究［J］．中国公共卫生，2007，23（3）：301－302．

［5］ Rosenbiatt H M，Byrne W，Arnent M E，etal．Successful treatment of chronic mucocutaneoous candididesis with ketoconazole［J］．J Pediatr，1980，97（4）：657．

［6］ White T C，Marr K A and Bowden R A．Clinical，cellular，and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance［J］．Clin Microbiol Rev，1998，11（2）：382－402．