复方清热颗粒对鲍氏不动杆菌外排泵影响的实验研究*

杨凤春 任爱民 王 红 张淑文

（首都医科大学附属北京友谊医院，北京 100050）

鲍氏不动杆菌属于条件致病菌，是目前医院感染的重要病原菌之一，成为仅次于铜绿假单胞菌的第2位非发酵菌［1-2］。多项研究［2-4］表明复方清热颗粒具有抗菌活性，可以改善细菌的耐药性。本实验从中药复方清热颗粒入手，观察其对鲍氏不动杆菌的耐药性的影响，以探讨复方清热颗粒能否改善外排泵阳性鲍氏不动杆菌的耐药情况。

1 材料

1.1 动物及菌株 健康大耳白兔，体质量1.8~2.5 kg，购自首都医科大学动物实验房，实验前适应性喂养1周，监测并记录心率、呼吸频率、肛温、体质量及摄食情况。实验菌株为2012年3月至2012年9月北京友谊医院住院患者分离的鲍氏不动杆菌，所有菌株均经法国生物梅里埃VITEK全自动微生物系统鉴定。质控菌株为铜绿假单胞菌ATCC27853，北京友谊医院检验中心保存菌株。

1.2 药物和试剂 环丙沙星（CIP）购自上海董李贸易有限公司，批号：85721-33-1，纯度≥98％；西黄耆胶，购自上海蓝季科技发展有限公司；复方清热颗粒，由蒲公英、败酱草、虎杖、半枝莲、大黄、黄芪组成，购自北京康仁堂药业有限公司；碳酰氰基-对-氯苯腙（CCCP）购自美国Sigma公司；DMSO购自美国Sigma公司；血琼脂培养皿购自天津金章科技发展有限公司；M-H琼脂粉购自BD公司。

1.3 实验设备 电热恒温培养箱 DH6000AB型，天津市泰斯特仪器有限公司。光电比浊仪，法国，生物－梅里埃公司。

1.4 统计学处理 应用SPSS17.0统计软件。所有数据以（±s）表示。数据呈正态分布者，计量资料采用t检验，两组间的比较采用配对t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 方法与结果

2.1 含药血清的制备 将14只大耳白兔随机分为两组，模型组8只，对照组6只。禁食12h，模型组给予腹腔注射多重耐药鲍氏不动杆菌菌液，注射剂量2.5×109/kg，12 h后测肛温、血常规，体温＞39.5℃、白细胞总数＞13×109/L者入选，模型组有6只白兔符合上述标准而入选。造模成功后分别记录模型组及对照组大耳白兔的心率（HR）、呼吸频率（R）、肛温（T）、体质量（W）及摄食情况。模型组于造模成功后第2日开始给予复方清热颗粒剂药液灌胃，每日 2 次，剂量为 22 g/（kg·d），连续给药5 d。对照组给予同等体积的蒸馏水灌胃，同样是每日2次，连续5 d。治疗期间监测并记录两组大耳白兔的心率、呼吸频率、肛温、体重及摄食情况，同时各组大耳白兔每日均正常饲料喂养，治疗结束后禁食12 h，无菌心脏采血，4000 r/min离心10 min，分离出含药血清和空白血清后同组混和，-20℃冰箱保存备用。各组治疗前后R，HR，T，W的变化见表1。

2.2 CCCP工作浓度的确定 准确称取CCCP粉剂，先用少量DMSO溶解，然后再加无菌蒸馏水至所需体积。分别配制 2000、1000、500、200、100、50 μg/mL 的CCCP溶液，过滤除菌备用。于每个平板（直径90 mm）中对应加入上述CCCP溶液2 mL和已消毒并冷却至50℃左右的MH培养基18 mL，充分混匀，配成分别含有终浓度为 200、100、50、20、10、5 μg/mL 的含 CCCP琼脂平板，将32株临床分离的耐环丙沙星鲍氏不动杆菌分别划线接种于上述配制好的琼脂平板，同时接种不含CCCP的琼脂平板做对照，接种量为1×105CFU/mL，接种完毕后置36℃恒温箱中培养20 h，观察结果。在CCCP终浓度为200 μg/mL时，无菌株生长；在CCCP终浓度为100 μg/mL时，有16株鲍氏不动杆菌不生长，其他菌株均生长良好；在CCCP终浓度为50 μg/mL时，有6株鲍氏不动杆菌不生长，其他菌株均生长良好；在 CCCP 终浓度分别为 20、10、5 μg/mL 时，所有菌株均生长良好，且形态染色及菌落特征典型。故20、10、5 μg/mLCCCP均可作为实验用外排泵抑制剂CCCP的工作浓度。本实验中采用浓度10 μg/mL的CCCP。

2.3 筛选外排泵阳性鲍氏不动杆菌 选出临床分离的耐环丙沙星鲍氏不动杆菌32株，分别挑取单个菌落平板划线于血琼脂培养皿中，36℃恒温培养箱中培养20 h，然后分别挑取单菌落，用生理盐水稀释，比浊仪调节菌液至0.5麦氏浓度约108CFU/mL，同法配制铜绿假单胞菌ATCC27853菌悬液作质控。制备含环丙沙星的MH琼脂平皿，CIP的质量浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL， 将 32 株鲍氏不动杆菌分别接种于已配制好的含不同浓度环丙沙星的MH琼脂平皿中，细菌接种量约为105CFU。即采用琼脂对倍稀释法测出CIP对上述32株鲍氏不动杆菌的最小抑菌浓度（MIC）值（药物敏感试验的操作及结果的解释参照美国临床实验室标准委员会（CLSI）2011版标准［5］）。称取 4 mg CCCP，用 2 mL 二甲基亚砜将其充分溶解，再用8 mL蒸馏水将浓度稀释至400 μg/mL。将配制的CCCP溶液加入到含不同浓度环丙沙星的琼脂平皿中，每个平皿中均加入0.5 mL，使每个平皿中CCCP的浓度均为 10 μg/mL，CIP质量浓度分别为0.125、0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。并设一空白对照组和CCCP浓度为10 μg/mL的对照组。将32株鲍氏不动杆菌菌悬液及质控菌株菌悬液接种于上述培养基中，接种细菌量均为105CFU，36℃温箱中培养20 h，测出环丙沙星联合CCCP时对上述32株鲍氏不动杆菌的MIC值。比较上述两组MIC值，如在有CCCP的情况下MIC值下降至原来的1/4或以下，即认为该菌株为外排泵阳性菌株［6］（根据MIC值大小分别命名为Pa1～Pa8，见表2），空白MH琼脂平板和CCCP浓度为10 μg/mL琼脂平板上细菌均生长良好。

2.4 外排泵阳性鲍氏不动杆菌株的药敏结果 （1）测定含药血清及空白血清MIC值：配制20 mL含药血清及空白血清MH琼脂平皿，含药血清含量分别为0.5、1、2、4 mL，空白血清含量分别为 0.5、1、2、4 mL。接种上述8株鲍氏不动杆菌菌悬液及质控菌株菌悬液于含药血清及空白血清琼脂平皿中，细菌接种量约为105CFU，于36℃恒温箱培育20 h。上述4个含药血清及空白血清MH琼脂平皿上8株鲍氏不动杆菌菌均生长良好。未测出含药血清及空白血清的MIC值。（2）测定复方清热颗粒的MIC值：称取1g复方清热颗粒，加入25 mL蒸馏水中，使之充分溶解，过滤除菌备用。配制含中药复方清热颗粒的MH琼脂平皿，中药浓度分别为0.625、1.25、2.5、5、10、20 mg/mL。分别接种上述 8 株菌悬液及质控菌株菌悬液约105CFU于其中，并于36℃恒温箱培育20 h，各MIC值见表3。（3）测定复方清热颗粒+CIP组MIC值：制备含复方清热颗粒和CIP的MH琼脂平皿，分为4组，每组CIP的质量浓度均包括0.25、0.5、1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。4 组的中药浓度分别为 0.625、1.25、2.5、5 mg/mL。分别接种 8株菌悬液及质控菌株悬液于各MH琼脂平皿中，细菌接种量约为105CFU，并于36℃恒温箱培育20 h，各组MIC值见表4。CIP组与CIP+中药2.5 mg/mL组比较，差异明显（P＜0.05）；CIP组与CIP+中药5 mg/mL组比较，差异明显（P＜0.01）。（4）测定空白血清+CIP 组、含药血清+CIP组MIC值：配制含空白血清和CIP的MH琼脂平皿，每个平皿中均加入空白血清2 mL，CIP浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL （命名为1组）。接种上述菌悬液于MH琼脂平皿，细菌接种量约为105CFU，并于36℃恒温箱培育20 h。配制含药血清和CIP的MH琼脂平皿，分为3组，每组CIP的质量浓度均包括 1、2、4、8、16、32、64、128、256 μg/mL。3 组琼脂平皿中含药血清分别为0.5、1、2 mL（命名为2、3、4组）。分别接种上述菌悬液及质控菌株菌悬液于MH琼脂平皿，菌量约为105CFU，并于36℃恒温箱培育20 h，CIP组、空白血清+CIP组、含药血清+CIP组MIC值比较见表5。CIP组与CIP+含药血清2 mL组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。（5）测定空白血清＋CCCP＋CIP组、含药血清＋CCCP＋CIP组、复方清热颗粒＋CCCP＋CIP组MIC值：制备MH琼脂平皿，每个琼脂平皿中均含空白血清 2 mL，CCCP的浓度均为 10 μg/mL，CIP的浓度分别为 1、2、4、8、16、32、64、128 μg/mL。分别接种上述菌悬液及质控菌株菌悬液于MH琼脂平皿，菌量约为105CFU，36℃恒温箱培育20 h。同样方法测定含药血清＋CCCP＋CIP组MIC值，每个MH琼脂平皿中均包含含药血清2 mL，CCCP浓度、CIP浓度均同上。同样方法测定复方清热颗粒＋CCCP＋CIP组MIC值，每个MH琼脂平皿中复方清热颗粒浓度均为2.5 mg/mL，CCCP浓度、CIP浓度同上，以上分别命名为1、2、3组，各组MIC值比较见表6。CIP+CCCP组与复方清热颗粒+CIP+CCCP组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。

表1 两组治疗前后R，HR，T，W的变化（，±s）

表1 两组治疗前后R，HR，T，W的变化（，±s）

与治疗前比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组 别（n＝6） 治疗后模型组 治疗前（n＝8） 治疗后对照组 治疗前R（次/min） HR（次/min） T（℃） W（kg）80.53±11.92 233.33±19.52 39.03±0.34 2.20±0.086 105.50±4.64 251.67±11.69 40.23±0.27 2.38±0.16 98.97±5.49* 235.23±17.84*39.58±0.29**2.33±0.15 78.48±15.73 233.01±23.90 39.00±0.43 2.19±0.12

表2 应用CCCP前后CIP对外排泵阳性鲍氏不动杆菌MIC（μg/mL）值变化

3 讨论

随着对主动外排系统的深入研究，研究发现，越来越多的临床常见病原菌存在与耐药有关的主动外排系统，细菌主动外排作用已被认为是细菌产生耐药性的重要机制。有研究表明［5］主动外排泵是介导鲍氏不动杆菌多重耐药及泛耐药的主要机制之一，与鲍氏不动杆菌多重耐药有关的主动外排系统主要包括Ade-ABC、AdeIJK、AdeFGH，属于 RND 家族。

为了减少细菌的多重耐药性，笔者从细菌主动外排泵耐药机制入手，寻求抑制主动外排泵的方法。CCCP是一种抑制质子转运的解耦联剂，可以抑制主动外排系统能量来源的质子浓度梯度，破坏外排系统的主动外排作用，使抗菌药物在细菌体内的累积量增加，恢复细菌对抗生素的敏感性，但由于毒副作用过大，限制了其在临床中的使用。这就需要研发新的毒副作用小的药物或寻求其他途径来改善细菌耐药性［6］。

表3 复方清热颗粒对鲍氏不动杆菌MIC值的影响（mg/mL）

表4 应用复方清热颗粒（mg/mL）前后CIP对8株外排泵阳性鲍氏不动杆菌MIC值（μg/mL）

表5 应用空白血清、含药血清前后CIP对鲍氏不动杆菌MIC 值（μg/mL）

表6 空白血清+CCCP+CIP、含药血清+CCCP+CIP组、复方清热颗粒+CCCP+CIP组MIC值（μg/mL）

本研究以中药复方清热颗粒含药血清为主要研究对象，以空白血清作为对照，并且和复方清热颗粒剂原液组进行比较，观察环丙沙星及环丙沙星分别联合含药血清、空白血清及复方清热颗粒剂原液后对外排泵阳性鲍氏不动杆菌MIC值的变化。其后，在泵抑制剂CCCP抑制了外排泵后，观察环丙沙星及环丙沙星分别联合含药血清、空白血清及复方清热颗粒剂原液后对外排泵阳性鲍氏不动杆菌MIC值的变化。实验表明：（1）环丙沙星＋含药血清组的MIC值与环丙沙星组比较，MIC值明显下降，说明含药血清能明显改善外排泵阳性鲍氏不动杆菌对环丙沙星的耐药情况。（2）环丙沙星＋含药血清＋CCCP组的MIC值与环丙沙星＋CCCP组比较，差异无统计学意义，而上面实验结果显示含药血清能明显改善鲍氏不动杆菌对环丙沙星的耐药情况，说明CCCP阻断外排泵后含药血清改善鲍氏不动杆菌对环丙沙星耐药的作用减弱，从而提示含药血清可能是通过抑制鲍氏不动杆菌的外排泵来改善鲍氏不动杆菌对环丙沙星的耐药性。（3）环丙沙星＋中药原液组较环丙沙星组MIC值下降，差异有统计学意义，说明中药能改善鲍氏不动杆菌对环丙沙星的耐药情况。此外，环丙沙星＋CCCP＋中药组MIC值较环丙沙星＋CCCP组MIC值明显下降，表明中药原液可能是通过多种途径改善鲍氏不动杆菌对环丙沙星的耐药情况。

［1］Ji Hoon，Ba Ang， Peter Axelrod.Longitudinal epidemiology o multidrug-resistant （MDR）Acinetobacter species in a tertiary care hospital［J］.American Journal of Infection Control，2011，8（11）：326-330.

［2］Ioannis K，Neonakis，Demetrios AS，et al.Confronting multidrug-resistant acinetobacter baumannii：a review［J］.International Journal of Antimicrobial Agents，2011，7：102-109.

［3］于一云，王红，张淑文，等.复方清热颗粒剂对MRSA PBP2a表达影响的实验研究 ［J］.中国中医急症，2009，18（9）：1483-1486.

［4］杨钧，张淑文，阴宏，等.复方清热颗粒剂含药血清对超广谱β-内酰胺酶的抑制作用［J］.中国实验方剂学杂志，2007 13（11）：40-43.

［5］Clinical and laboratory standards institute（CLSI）/NCCLS performance standards for antimicrobial susceptibility testing：twenty-First informational supplement M100-S21（ISBN 1-56238-742-1）M07-A8-Methods for dilution antimicrobia susceptibility tests for bacteria［J］.M100-S21，2011，31（1）：1-163.

［6］马真，蔡绍曦，佟万成.耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌外排泵AdeABC 的研究［J］.南方医科大学学报，2011，31（8）：1378-1381.