过氧化物酶体增殖物激活受体β／δ激动剂GW0742对硝酸甘油诱导偏头痛大鼠的作用

肖明明，何 秋，任占秀，陈晓虹

（辽宁省人民医院1．病理科；2．神经内科，辽宁 沈阳110016）

偏头痛（migraine）是一种常见的神经系统疾病。最新流行病学调查表明，我国偏头痛的患病率、发病率有逐年上升的趋势［1］。过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators－activated receptor，PPAR）是核受体超家族成员之一，包括PPARα、PPARβ／δ 和 PPARγ 三种表型。PPARα和PPARγ激动剂的抗炎作用已通过大量研究证实，但是 PPARβ／δ的作用仍不十分清楚［2］。研究PPARβ／δ在炎症等疾病中的表达可能具有十分重要的意义［3］。因此，建立客观有效的偏头痛实验动物模型，深入研究PPARβ／δ激动剂对偏头痛的发病机理及防治措施十分必要。

1 材料与方法

1．1 材料

硝酸甘油购于广州白云山制药有限公司；PPARβ／δ，IL－6，ICAM－1，MMP－9试剂盒购于Santa Cruz公司；GW0742由Sigma生产，批号：096K 4711。GW0742溶于二甲基亚砜溶剂（dimethylsulfoxide，DMSO）中。

1．2 实验分组及造模

48只SD雄性大鼠（体重180－220g）由沈阳药科大学实验动物部提供。动物许可证号，No：SCXK（辽）2010－0001。按体重均衡原则，将大鼠随机分成：正常对照组、模型组和GW0742组，每组16只。模型组按Tassorelli Cristina法采用腹腔皮下注射硝酸甘油复制大鼠偏头痛模型。GW0742组在造模后3 0min腹腔给予 GW0742 0．3mg／kg。正常对照组不做处理。

1．3 偏头痛模型制备

取大鼠称重，大鼠按9．5mg／kg皮下注射硝酸甘油5－10min所有造模后大鼠出现双耳发红，肢频繁挠头、爬笼次数增多、烦躁不安等现象。据模型评分标准（潜伏期后5min，计分达6分为造模成功）。对照组大鼠皮下注射等体积生理盐水，大鼠仅在15 min内略有挠头现象，之后趋于正常，且未出现双耳发红、爬笼次数增多和其他烦躁不安现象［4］。

偏头痛模型评价：根据本研究预实验结果，潜伏期后5min内出现症状最为集中和明显。所以确定潜伏期后5min计分达6分为造模成功。前5 min搔头：10次＝1分（依10次为基数，增加1次，增加0．1分），打转：2次＝1分（增加1次，增加1分），爬笼：3次＝1分（增加1次，增加0．1分），烦躁：往返运动1次＝1分（增加1次，增加1分），咬尾：1次＝1分，耳红：出现＝1分［5］。

取材：造模成功4h后，10%水合氯醛麻醉后暴露心脏，从心尖插入灌流针直至主动脉，剪开右心耳，用0．9%生理盐水冲洗至流出水无色后，每组取8只鼠的脑干三叉神经颈复合体，迅速置入液氮中保存，备用于western blot检测；另8只鼠在上述生理盐水冲洗后用4%多聚甲醛灌流，直至脑组织发白、质地较硬后灌流结束。断头取脑干三叉神经颈复合体，放入4%多聚甲醛液中固定，24h后移入70%乙醇中保存，常规石蜡脱水、包埋，待做免疫组化。

1．4 免疫组织化学

石蜡组织切片行常规HE染色，显微镜下观察确定组织结构未被破坏，行脱蜡和水化后，用0．01 mmol／L枸橼酸盐修复，冷却至室温；新配的3%H2O2，室温下处理10min，蒸馏水洗涤切片2min×3次；滴加封闭用正常山羊血清工作液体，37℃孵育20min；滴加适当一抗［PPARβ／δ（1∶200）、IL－6（1∶200）、ICAM－1（1∶200）、MMP－9（1∶200）］，4℃过夜；PBS冲洗，3min×3次，滴加生物素抗体，37℃孵育20min；PBS冲洗，3min×3次，滴加适量的辣根酶标记的链霉卵白素工作液，37℃孵育20 min，PBS冲洗，3min×3次，DAB显色：取1ml蒸馏水分别加入A、B、C试剂各一滴，混匀后加至切片上，显色5－10min，水洗；苏木素轻度复染，水洗，脱水、透明、封片，镜检观察。

结果判断：PPARβ／δ蛋白定位于细胞核，IL－6、ICAM－1、MMP－9蛋白定位于细胞质。根据阳性细胞百分率评分：无阳性细胞为（－），阳性细胞数≤10%（＋），11%≤阳性细胞数≤50%为（＋＋），阳性细胞数≥51%为（＋＋＋）。

1．5 Western－blot印 迹 法 检 测 PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9表达

1．5．1 蛋白提取 分别取冻存的组织，加0．5ml冰冷蛋白裂解缓冲液（0．1mM Tris－HCl pH7．6，1 mM EDTA pH8．0，1μg．ml－1Aprotinin，100μg·ml－1PMSF），冰浴中匀浆，4℃、10 000×g离心1h；弃上清，沉淀物中加入0．5ml细胞核或膜裂解缓冲液，超声粉碎，4℃、20 800×g离心1h，吸出上清（分别含胞核蛋白或胞膜蛋白），采用Folin－酚试剂法进行蛋白定量，－70℃保存待用。

1．5．2 Western－blot印迹 分别取含30μg含胞核蛋白或胞膜蛋白的上述溶液，加在10%SDS－聚丙烯酰胺凝胶中，在pH 为8．3的0．025M／L Tris－192μm／L 甘氨酸－0．1%SDS中电泳（120V、38 mA）2h。电转移到硝酸纤维薄膜上，转印膜在牛血清白蛋白中封闭1小时后，分别在一抗［PPARβ／δ（1：200）、IL－6（1∶200）、ICAM－1（1∶200）、MMP－9（1∶200）］中4℃孵育过夜。次日，充分清洗转印膜后，转入碱性磷酸酶（1∶3000稀释）标记的二抗中室温孵育2h，PBS冲洗3次，显色30s。凝胶自动成像仪扫描成像，图像分析仪对显示的蛋白电泳条带进行数据分析。

1．6 统计学处理

测定数值以均数±标准差（¯x±s）表示，两组间均数比较用t检验，统计学分析用SPSS13．0统计软件处理，差异具有统计学意义（P＜0．05）

2 结果

2．1 大鼠行为学变化

造模5－10min后大鼠出现耳发红，肢频繁挠头、爬笼次数增多、烦躁不安等现象约30min达高峰。此现象可持续1h。继之大鼠呈现蜷卧，活动减少状态。期间无大鼠死亡，根据偏头痛模型评价，大鼠模型结果符合标准。

2．2 免疫组织化学

模型组大鼠三叉神经颈复合体中PPARβ／δ表达强度明显高于正常对照组。同时模型组大鼠三叉神经颈复合体IL－6、ICAM－1、MMP－9表达强度明显高于正常对照组，给予PPARβ／δ激动剂GW0742大鼠三叉神经颈复合体IL－6、ICAM－1、MMP－9表达强度下降（图1）。

图1 免疫组化法检测大鼠脑干三叉神经颈复合体PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9蛋白表达（SP染色法×100）

2．3 Western blot检测

模型组大鼠三叉神经颈复合体PPARβ／δ表达明显高于生理盐水对照组，GW0742组PPARβ／δ表达明显高于模型组，差异均有统计学意义。同时模型组大鼠IL－6、ICAM－1及 MMP－9表达明显高于生理盐水组，给予PPARβ／δ激动剂GW0742大鼠IL－6、ICAM－1及 MMP－9表达下降，差异有统计学意义（图2、3）。

3 讨论

图2 Western bolt法检测大鼠脑干三叉神经颈复合体PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及 MMP－9蛋白表达

图3 大鼠三叉神经颈复合体PPARβ／δ、IL－6、ICAM－1及MMP－9蛋白表达（各组与参照密度值比值，¯x±s，n＝24）

偏头痛（migraine）是一种常见的神经系统疾病。在偏头痛发病机制的诸多学说中三叉神经－血管反射学说占主导地位，越来越受到广泛关注。偏头痛的发生是由于某种原因激活了脑血管周围的三叉神经末梢，三叉神经周围血管纤维释放血管活性肽等，使脑膜血管过度扩张，血浆蛋白渗出，肥大细胞释放组胺，引起硬膜和其他三叉神经分布组织发生神经源性炎症，这种伤害性刺激沿着三叉神经传入纤维传至三叉神经核尾部，冲动达到延脑化学感受区，引起恶心、呕吐；传入下丘脑，出现畏光症状，传入大脑皮质产生痛觉［6］。

过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferators－activated receptor，PPAR）是配体活化的核转录因子，其活化后能产生多种生物学作用，如调解脂质代谢、提高胰岛素敏感性和抗肿瘤作用等。PPAR 包括 PPARα、PPARβ／δ 和 PPARγ 三种亚型。在这三种亚型中，PPARα和PPARγ激动剂的抗炎作用已通过大量研究证实，但是，另一种亚型PPARβ／δ的研究相对滞后，其作用还不十分清楚［6］。PPARβ／δ在中枢神经系统中表达最丰富，于各脑区神经元、胶质细胞、脑血管内皮和单核巨噬细胞等细胞均有表达［7］。

GW0742为 PPARβ／δ 的特异性激动剂，与GW501516一起于2003年首次确认［8］。鉴于偏头痛时产生神经源性炎症，因此本实验研究偏头痛时PPARβ／δ的表达及GW0742对偏头痛的作用，对预防和治疗偏头痛可能具有十分重要的意义。

本实验 中偏头 痛 模 型 组 中IL－6、ICAM－1 及MMP－9表达增强，PPARβ／δ表达上调。PPARβ／δ激 动 剂 使 偏 头 痛 鼠 炎 性 因 子 IL－6、ICAM－1 及MMP－9表达下调，提示PPARβ／δ在偏头痛高度表达，PPARβ／δ激动剂具有抗炎作用。Wahli W 等［9］研究表明PPARβ／δ可以推迟TNF－α等炎症因子在损伤部位的产生，调节细胞适应应激状态，远离炎症因子的凋亡信号，还能控制巨噬细胞的炎症状态。PPARβ／δ激动剂可以强有力的减少INF－γ和LPS诱导的 TNF－α和IL－6及iNOS、COX2的表达上调［10］；给予 PPARβ／δ激动剂后发现 MCP－1、IL－1β的表达水平下降［11］。Northern blot分析发现 MCP－1、IL－1β和 MMP－9是PPARβ／δ控制巨噬细胞炎症的重要靶点。不仅如此，在之前作者的研究中已经证实PPARβ／δ的抗炎性可以通过NF－κB途径调节介导，使下游炎症因子如IL－1、IL－6、TNF－a、ICAM－1表达减少，从而减少炎症因子的启动，达到控制炎症的作用［12］。本实验与上述实验结果一致，表明PPARβ／δ可能通过下调IL－6、ICAM－1 及 MMP－9等炎性因子表达而发挥抗炎作用［8－10］，同时也说明PPARβ／δ激动剂GW0742通过抗炎机制对偏头痛起保护作用。

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