儿童再生障碍性贫血骨髓间充质干细胞GATA－2基因表达的研究

王 玥，薛 露，马 翠，何永艳，孙鸿雁，李春怀

（吉林大学第一医院 小儿血液肿瘤科，吉林 长春130021）

再生障碍性贫血（aplastic anemia，AA）发病机制复杂，通常被认为是免疫介导的造血功能衰竭，先前的研究证实AA患者存在免疫细胞及分子异常导致的造血干细胞及骨髓 MSC的功能损伤［1，2］，导致红骨髓总容量减少，代以脂肪髓，临床以全血细胞减少为主要表现的一组综合征。

GATA－2为转录因子GATA家族成员，亦属锌指结构家族，可识别和结合靶基因的特异性［T／A（GATA）A／G］序列并因此得名。在早期造血干／祖细胞及 MSCs中均有表达，并调节其增殖、分化［3，4］，是调节正常造血重要的转录因子，过去关于GATA－2与AA相关机制的研究主要集中于GATA－2表达下调对造血干细胞的影响［5］，而很少有报道骨髓造血微环境中骨髓MSCs的GATA－2表达情况。为了探讨GATA－2在AA儿童治疗前后骨髓MSC的表达水平变化及其在AA发病机制中可能的作用，我们采用QRT－PCR法对38例AA患儿和20例正常对照组骨髓MSC GATA－2表达进行检测。

1 材料和方法

1．1 研究对象

2008年10月至2011年10月在吉林大学第一医院小儿血液科收治的38例AA患儿均为重症AA，所有病例均经过外周血象、骨髓象、骨髓活检，符合再障诊断标准及分型标准［6］。其中男20例，女18例，年龄2－13岁，平均7岁。正常对照组20例来自于骨髓细胞形态学检查正常的非血液病患儿，其中男9例，女11例，年龄2－12岁，平均5岁。38例患儿中30例接受免疫抑制治疗（环孢素、雄激素），其中7例曾应用ATG治疗，疗效评价按照1987年第四届全国再生障碍性贫血学术会议修订的疗效标准［7］，对治疗有反应组包括为疗效基本治愈、缓解、明显进步的患儿，22例获得治疗2年骨髓标本，8例失访，12例患者获得缓解。患者及正常志愿者对试验方案均知情同意，并经医院伦理委员会批准后收集经肝素抗凝的骨髓液4ml。

1．2 主要试剂及仪器

淋巴细胞分离液（天津TBD公司）；DMEM培养基、胎牛血清和胰蛋白酶 （Hyclone公司）；Trizol试剂、所有引物（Invitrogen公司）；反转录试剂盒和荧光定量聚合酶链反应（PCR）试剂盒（日本TaKa－Ra公司）；流式细胞仪 （Becton Dickinson Biosciences公司）；荧光标记小鼠抗人抗体（BD公司）。

1．3 MSC的培养

取髂后上棘部位骨髓液4ml（肝素抗凝），用Ficoll淋巴细胞分离液（密度1．077）按密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞。把1×107单个核细胞／ml加入细胞培养体系中［MesenCult Basal Medium，包括人间充质干细胞富集试剂］，在25cm2的塑料培养瓶（CELLSTAR，Germany），于培养箱（37℃、5%CO2及饱和湿度）中培养。培养48h弃去培养液上清加入培养液继续培养。当贴壁细胞达80%瓶壁面积，用适量PBS液冲洗，以0．25%（w／v）胰蛋白酶溶液消化贴壁细胞。将消化的贴壁细胞计数，根据细胞数分瓶继续培养。第3代MSC用于后续试验。

1．4 MSC的鉴定

FACS Caliber流式细胞仪检测MSC免疫抗体表达。第3代MSC胰蛋白酶消化冲洗后，1×105细胞加入5μg单克隆抗体，4℃，30min。以PBS（含1%胎牛血清）冲洗细胞，重悬于300μl PBS液中待检。采用流式细胞仪检测第3代MSCs表面标志CD29，CD44，CD45，CD34，CD90，CD105表达水平。荧光标记小鼠抗人抗体购于BD公司，以同型IgG作为阴性对照，结果用CellQuest软件分析。

1．5 RNA提取和cDNA合成

总RNA的提取：选择生长状态较好的3代MSCs和 AA－MSCs，按每105－106个细胞加入 Trizol裂解液1ml，裂解后加入0．2ml氯仿，离心后吸取上清，加入0．5ml异丙醇，离心沉淀后弃上清，体积分数75%乙醇洗涤沉淀，最后加入适量1g／L DEPC处理过的无菌双蒸水溶解RNA。cDNA反转录合成：反转录反应体系为20μl，包括标本RNA 1μg，随机引物100ng和反转录酶等。

1．6 引物设计与合成

从美国生物技术信息中心（http：／／www．ncbi．nlm．nih．gov）的 Genbank数据库中检索 GATA－2基因 （ACCESSION M77810）和 GAPDH 基 因（HS99999905＿m1）的 mRNA序列。参照文献［8］中的引物序列设计上下游引物，并运用美国Whitehead生物医学研究所基因组研究中心（http：／／www．genome．wi．mit．edu）提供的Primer3程序设计探针，由上海基康生物技术有限公司合成Taqman荧光探针。在ABI 7300实时定量PCR仪上进行实时定量扩增。

1．7 实时定量PCR

为保证PCR扩增的有效性及分析的准确性，从AA患者及正常人 MSCs中提取总RNA，反转录合成cDNA，进行GATA－2和GAPDH的实时扩增并得到 Ct值，Ct值（cycle threshold）即 PCR 扩增过程中荧光信号开始由本底进入指数增长期的拐点所对应的循环次数，基因表达量的计算方法采用上海基康生物技术有限公司提供的标准品进行计算待测样本中基因表达量。PCR循环条件参见说明书。

1．8 统计学分析

实验数据用 Mean±SD表示，各个组间GATA－2／GAPDH比例采用t检验。采用 SAS 9．1统计软件进行统计分析，P＜0．05为差异有显著性。

2 结果

2．1 细胞形态学观察结果

骨髓中分离MSCs接种于培养瓶中，24h后即可观察到少量贴壁细胞生长，48h后去除悬浮细胞，贴壁细胞表现为成纤维细胞样，原代细胞形态不均一，第3代细胞铺满瓶底后呈长梭形、漩涡状分布，形态均一（图1）。

2．2 MSCs的表面标志

比较AA患者MSCs与正常人MSCs的表面标志，结果显示两者无明显差异，均不表达CD34，CD45，表达CD29、CD90、CD105及CD44（图2）。

图1 骨髓间充质干细胞（MSC）（×100）

2．3 再生障碍性贫血患者和正常人MSCs中GATA－2基因的表达水平比较（图3）

来自于AA儿童和正常对照组骨髓MSC传代至第三代时，经实时定量PCR检测GATA－2基因表达。AA儿童治疗前 MSC GATA－2基因表达水平与正常对照相比，明显减低（P＜0．05）；免疫抑制治疗2年后对免疫抑制治疗有反应的AA儿童GATA－2表达水平高于发病时，且与正常对照组表达水平无统计学差异（P＞0．05）。对免疫抑制治疗无反应的AA儿童GATA－2表达水平低于于发病时和正常对照组GATA－2表达水平（P＜0．05）。

图2 骨髓间充质干细胞（MSC）表面标志

图3 再生障碍性贫血患者免疫治疗前后和正常人间充质干细胞中GATA－2基因的相对表达量比较

3 讨论

骨髓MSCs是造血微环境的主要成分，具有自我更新及增殖能力，通过介导造血干细胞（hematopoietic stem cells HSCs）的黏附，分泌多种造血生长因子而发挥造血支持作用［9，10］，且具有调节免疫及维持免疫稳态的作用。多项研究证实AA患者骨髓 MSCs存在生物学性质异常［11，12］，例如增殖能力的下降，易于分化形成脂肪细胞等。

GATA－2是调节正常造血的重要转录因子之一，其稳定和平衡对于维持正常造血十分重要，在正常的造血过程中，随着造血细胞的分化及成熟，GATA－2的表达下调可以阻止正常造血细胞的增殖和分化［13，14］。过去关于转录因子 GATA－2与 AA 的发病机制的研究主要从造血干细胞方面着手，近年来随着骨髓MSCs分离及培养技术日益成熟，少数研究者开始关注AA患儿骨髓 MSCs的GATA－2表达情况，我们前期研究发现AA患儿病初MSCs中 GATA－2表达明显低于正常［16］，这与文献［15］报道一致，提示GATA－2的异常表达在AA的发病机制中发挥重要作用。为进一步证实GATA－2的表达变化在儿童AA的发病机制中作用，本文从转录水平上研究了AA患儿治疗前后骨髓MSCs中GATA－2基因表达变化情况。

研究结果表明AA患儿病初GATA－2基因表达水平明显低于正常儿童，且经免疫抑制治疗2年后，对免疫治疗有反应的患儿该基因表达水平较前明显提高，且治疗后该基因表达水平与正常对照组表达水平无统计学差别（P＞0．05）；而对免疫治疗无反应的患儿该基因表达水平较病初无明显变化，这一研究结果提示AA患儿体内的GATA－2基因表达异常参与发病过程及与AA患儿体内免疫异常密切相关。

GATA－2在早期造血干／祖细胞中表达，随着造血细胞分化、发育成熟，GATA－2表达下调。GATA－2在体内的表达有严格的“剂量依赖”效应，GATA－2的表达下调对细胞分化是必需的［18］。正常人骨髓中有GATA－2的低表达，在各类白血病患者中，GATA－2的表达增高。GATA－2在白血病中的高表达反映了造血干／祖细胞分化、发育阻滞，幼稚白血病细胞增多。反之，AA患儿骨髓造血干细胞和间充质干细胞中GATA－2表达均下调，提示两者增殖、分化能力下降，支持AA的造血干细胞数量和功能缺陷理论。

转录因子GATA－2可通过调节脂肪细胞特异性基因表达而调节脂肪细胞分化，其表达下降可导致脂肪细胞分化加速，脂肪细胞形成增多［4］，文献［16，17］研究表明AA患者 MSCs体外培养过程中易于向脂肪细胞分化，上述结果均支持临床中AA患儿骨髓脂肪化这一事实。

另外，本研究表明对免疫抑制治疗有效的患儿治疗后GATA－2表达较病初明显升高，而治疗无效的患儿该基因表达较发病时无明显变化，提示GATA－2基因表达异常与AA患儿体内免疫异常密切相关。IFN－γ在AA的免疫异常中发挥重要作用，我们前期研究发现AA患儿发病时PPARγ表达升高，且IFN－γ抑制GATA－2的表达，AA患儿经过免疫抑制治疗后GATA－2表达升高，此时是否存在PPARγ表达的降低，这一点尚需进一步证实。且IFN－γ与GATA－2之间的关系及作用机制尚需进一步研究。

总之，本研究发现了GATA－2基因在AA患者MSCs的表达明显低于正常人MSCs的表达，其差异有显著性意义，且经免疫治疗效果好的患儿该基因表达水平与正常人无明显差异，提示在AA发病机制的微环境改变中除MSCs的免疫异常外，GATA－2基因通过其与MSCs的相互作用也参与了对微环境的调控，这为了解MSCs在造血因子和成脂调控中的作用提供了进一步的证据，其相互作用关系及具体调控机制尚待进一步研究。

［1］Young NS，Calado RT，Scheinberg P．Current concepts in the pathophysiology and treatment of aplastic anemia［J］．Blood，2006，108：2509．

［2］Li JP，Zheng CL，Han ZC．Abnormal immunity and stem／progenitor cells in acquired aplastic anemia［J］．Crit Rev Oncol Hematol，2010，75：79．

［3］Yoko Okitsu，Shinichiro Takahashi，et al．Regulation of adipocyte differentiation of bone marrow storm cells by transcription factor GATA－2［J］．Biochemical and Biophysical Communications，2007，383．

［4］Tsai FY，Keller G，Kuo FC，et al．An early haematopoietic defect inmice lacking the transcription factor GATA－2［J］．Nature，1994；371：221．

［5］Rodrigues NP，Janzen V，Forkert R，et al．Haploinsufficiency of GATA－2perturbs adult hematopoietic stem－cell homeostasis［J］．Blood，2005，15：477．

［6］中华医学会第四届全国再生障碍性贫血学术会议纪要．再生障碍性贫血诊断标准［J］．中华血液学杂志，1987，8：486．

［7］中华医学会第四届全国再生障碍性贫血学术会议纪要，再生障碍性贫血疗效标准［J］．中华血液学杂志，1987，8：封4．

［8］Fujimaki S，Harigae H，Sugawara T，et al．Decreased expression of transcription factor GATA－2in haematopoietic stem cells in patients with aplastic anaemia［J］．Br J Haematol，2001，113：52．

［9］Kin DH，Yoo KH，Choi KS，et al．Gene expression profile of cytokine and growth factor during differentiation of bone marrow－derived mesenchymal sten cell［J］．Cytokine，2005，31（2）：119．

［10］赵智刚，唐晓琼，黎纬明，等．冻存前后骨髓间充质干细胞的生物学特性和支持造血研究［J］．中国实验血液学杂志，2006，14（2）：304．

［11］Bacigalupo A，Valle M，Podesta M，et al．T－cell suppression mediated by mesenchymal stem cells is deficient in patients with severe aplastic anemia［J］．Exp Hematol，2005，33：819．

［12］Chao YH，Peng CT，Harn HJ，et al．Poor potential of proliferation and differentiation in bone marrow mesenchymal stem cells derived from children with severe aplastic anemia［J］．Ann Hematol，2010，89：715．

［13］Koc ON，Lazarus HM．Mesenchymal stem cells：heading into the clinic［J］．Bone Marrow Transplant，2001，27：235．

［14］Dao MA，Nolta JA．Cytokine and integrin stimulation synergize to promote higher levels of GATA－2，c－myb，and CD34protein in primary human hematopoietic progenitors from bone marrow［J］．Blood，2007，109：2373．

［15］何 丽，肖 扬，蒋祖军，等．荧光定量聚合酶链反应检测GATA－1、GATA－2、过氧化物酶体增殖物激活受体γ和干细胞因子基因在再生障碍性贫血患者及正常人骨髓间充质干细胞中的表达［J］．中国组织工程研究与临床康复，2011，15（9）：3451．

［16］Yinyan Xu，Yoshiyuki Takahashi，Yue Wang，et al．Downregulation of GATA－2and overexpression of adipogenic gene－PPARg in mesenchymal stem cells from patients with aplastic anemia［J］．Experimental Hematology，2009，37：1393．

［17］王海燕，丁天凌，谢 毅，等．再生障碍性贫血患者骨髓间充质干细胞成脂和成骨分化能力的变化［J］．中华内科杂志，2009，48（1）：39．

［18］Persons DA，Allay JA，Allay ER，et al．Enforced expression of the GATA－2transcription factor blocks normal hematopoiesis［J］．Blood，1999，93：488．