脂联素在脂肪组织切口愈合中的作用及机制研究

濮 勇，陶 曙，姜 洋，肖 亮

（1．江苏大学附属人民医院 普外科，江苏 镇江212000；2．吉林大学中日联谊医院 普外科；3．深圳大学附属第一人民医院 生物治疗科）

切口并发症是最常见的腹部手术术后并发症，发生率约为7%－26%［1－3］。常见的切口并发症类型包括：脂肪液化、切口积液／血清肿、切口裂开、切口感染等。其中，脂肪液化是最常见的切口并发症，好发于肥胖患者。体重指数与血清脂联素水平负相关。脂联素（Adiponectin，ADPN）是脂肪细胞分泌的一种内源性生物活性多肽［4－7］。ADPN可通过与受体结合来激活AMPK增强胰岛素敏感性，增加促进骨骼肌细胞的脂肪酸氧化和糖吸收，明显加强胰岛素的糖原异生作用、抑制肝脏的糖生成，是机体的脂质代谢和血糖稳态的调控网络中的重要调节因子。在内皮细胞中的研究发现，ADPN可以通过和受体结合抑制Caspase蛋白的活化、抑制细胞凋亡，但ADPN是否可以抑制脂肪细胞凋亡及其介导细胞凋亡的具体通路仍然未知［8］。

1 材料与方法

1．1 材料

长白山大猪［购自广东省医学实验动物中心SLXY（粤）2006－0002］，重组人脂联素（Prospec公司），二 抗：Anti－Adiponectin Receptor 1antibody［EPR6626］（Rabbit monoclonal）及 Goat anti－Rabbit IgG H＆L （HRP）secondary antibody（英 国ABCAM 公司）；Anti－Adiponectin Receptor secondary antibody（Goat polyclonal）和 Donkey anti－Goat IgG H＆L （HRP）secondary antibody（英国ABCAM公司）；总蛋白提取试剂盒（欣百诺公司）；BCA蛋白定量试剂盒（健康元公司）；ECL发光试剂盒（pierce公司）；Annexin－V－FITC凋亡检测试剂盒（碧云天生物科技有限公司）。

1．2 制作ATWH动物模型

采用50kg重的长白山大白猪。取俯卧位，静脉诱导麻醉成功后，消毒铺巾。后背正中线为对称线，旁开3cm，左右两侧各取7个长约4cm切口，全层切开脂肪组织。两侧切口随机分为脂联素干预组和对照组。术后每天依次打开一个切口，留取局部脂肪组织，并观察脂肪组织切口愈合等级。

1．3 应用免疫荧光技术检测细胞凋亡

取脂肪组织常规固定，包埋，切片。脱蜡脱水后备用，用预冷的PBS洗涤3次。然后按试剂盒操作说明取AO和EB等体积混匀制成AO－EB荧光染液，用PBS按1∶25稀释后加10μl避光染色10 min。然后用预冷的PBS洗去未结合的染液，5%甘油封片，荧光显微镜检测。

1．4 应用电镜技术检测细胞凋亡

取脂肪组织经3%戊二醛前固定，2%锇酸后固定，缓冲液冲洗后，醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色过夜。清洗2次，梯度丙酮脱水，包埋，超薄切片机切片，JEM2000－EX透射电镜随机拍片。

1．5 统计学处理

计量资料以均数±标准差（¯x±s）表示，组间比较采用t检验；计数资料组间比较采用χ2检验。应用SPSS 16．0软件做统计分析。以P＜0．05为有统计学意义。

2 结果

2．1 切口愈合等级

脂联素干预组Ⅰ期切口愈合等级明显优于对照组，两组之间的差异有统计学意义（P＜0．05）。两组切口脂肪液化发生率及切口感染发生率差异均无统计学意义（P＞0．05）（表1）。

表1 两组之间切口愈合情况的比较

2．2 荧光标记法观察猪ATWH中脂肪细胞凋亡的变化

分别于术后第3d及第5d应用荧光标记法观察猪ATWH中脂肪细胞凋亡的变化。荧光显微镜扫描结果提示，两组脂肪细胞都存在细胞凋亡，第3 d和第5d脂联素干预组出现凋亡的脂肪细胞均远低于对照组（P＜0．05）。见图1、表2。

图1 A脂联素干预组术后第3d见少量脂肪细胞凋亡，脂肪组织结构清晰；B对照组术后第3d见大量脂肪细胞凋亡，脂肪组织溶解；C脂联素干预组术后第5d见少量脂肪细胞凋亡，脂肪组织结构清晰；D对照组术后第5d见中等脂肪细胞凋亡，脂肪组织结构紊乱。

表2 两组之间脂肪细胞凋亡数目的比较（n＝35）

2．3 电镜观察猪ATWH中脂肪细胞凋亡的变化

分别于术后第3d及第5d应用电镜观察猪ATWH中细胞凋亡差别。电镜结果提示，两组脂肪细胞之间都存在细胞凋亡的表现；第3d和第5d对照组的凋亡程度及范围远远高于脂联素干预组。见图2。

图2 A脂联素组术后第3d见线粒体结构肿胀，细胞核结构完整；B对照组术后第3d见细胞核膜破裂，核质浓缩，细胞已发生不可逆凋亡；C脂联素术后第5d见胞浆线粒体肿胀好转，细胞结构完整；D对照组术后第5d见胞浆结构不清晰，无法区别细胞器结构。

3 讨论

切口愈合一直是国内外研究热点，但主要集中在疤痕、糖尿病创面模型、血管生成、干细胞、炎症反应等［9－21］。针对ATWH过程中出现的各种问题的研究还未起步；对于脂联素促进ATWH过程中的分子机制尚未见报道。在本实验研究之前，课题组进行了大量临床随机对照试验，通过改良手术操作细节，提高ATWH等级，仍无法达到理想的愈合效果。说明ATWH过程极其复杂，ATWH的机制未完全阐明。

近年来，脂联素是国内外的研究热点。大量文献报道，脂联素具有抗炎、抗糖尿病、抗动脉粥样硬化和增敏胰岛素的作用。但脂联素与ATWH的关系尚未见报道。本实验首次观察到脂联素明显促进ATWH，脂联素的表达水平与脂肪细胞的凋亡率呈负相关，此研究结果为初步阐明脂联素促进ATWH的机制奠定了坚实基础。但迄今为止，脂联素两种受体在信号传递过程中的具体作用现在仍不清楚，这是一个非常值得进一步研究的问题。

另外，本实验证实脂联素可以抑制脂肪细胞凋亡，但是其介导细胞凋亡的具体通路仍然未知［11］。这些将指引我们在前期研究的基础上，继续全面深入地研究脂联素在ATWH中的抗凋亡作用及机制，并在临床实践中验证基础研究结论，为将脂联素应用到临床手术切口并发症的防治中提供依据。

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